穴位埋线对癫痫大鼠认知行为、海马神经元丢失程度及BDNF蛋白表达的影响*

刘 征,马 琳,毕海洋，王瑞莹,胡其回,戚素梅,刘红玉,梁芳妮,于楠楠△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

癫痫是一种脑部神经元过度同步化放电所致的发作性脑病。作为神经系统难治性疾病，癫痫反复发作会引起神经元损伤，使其产生不可逆的凋亡或死亡。而海马神经细胞的脱失又可造成癫痫患者认知功能障碍，且可能与慢性癫痫发作易感性关系密切，因此探索多种方式对海马神经元的保护作用，或可起到减少癫痫发作及缓解癫痫发作程度、改善认知功能的作用[1]。已有临床研究证实，穴位埋线治疗癫痫可以减少患者复发率，改善发作时的意识状态，减少抽搐持续时间并提高患者生活质量[2]。笔者通过建立氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型，观察穴位埋线对癫痫大鼠认知行为学、海马神经元丢失程度及脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达的影响，以期为穴位埋线治疗癫痫伴认知障碍提供更详实的动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物的选择与分组情况

随机将体质量180～200 g的80只SPF级成年雄性SD大鼠[许可证号：SCXK(黑)2013004，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供]分4组：空白组、模型组、埋线组和西药组，每组各20只，常规适应性喂养1周后，准备进行模型制作[3]。严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》对动物进行处置。

1.2 实验药物

氯化锂 (北京智杰方远科技有限公司，100 g/瓶，批号：115K1708)；盐酸匹罗卡品 (美国Sigma公司，5 g/瓶，批号：096k1730)；硫酸阿托品 (遂成药业股份有限公司，0.5 mg/瓶，批号：H41031257)；左乙拉西坦(UCB Pharma S.A.,0.5 g/片，批号：H20170254)。

1.3 模型制备

分组后第1天15：00，在清醒状态下对模型组大鼠腹腔注射氯化锂溶液(127 mg/kg)，第2天上午09：30腹腔注射硫酸阿托品溶液(1 mg/kg)，以减轻匹罗卡品所引起的外周不良反应；同日10：00再次腹腔注射匹罗卡品溶液，20 mg/kg为首次给药的剂量[5]。随后密切观察大鼠的行为学变化，按表1中的Racine评分标准[4]评估大鼠癫痫的发作强度，造模成功的标准为：大鼠在给药后1 h内出现Ⅳ级～Ⅴ级发作。若大鼠发作未达到IV～V级，则每隔30 min给予腹腔注射匹罗卡品1次(10 mg/kg)，注射达极量50 mg/kg后，仅出现Ⅲ级以下一过性发作则视为未点燃，予淘汰处理。若大鼠癫痫持续状态超过1 h或出现脱水的症状，立即腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)止痫以降低死亡率，若效果不佳则30 min后补注射1次。

表1 Racine评分标准

1.4 干预方法

正常组和模型组常规饲养，不做任何处理。

1.4.1 西药组 予左乙拉西坦混悬液灌胃，180 mg/kg(相当于人类15 mg/kg)每日1次，总计持续28 d。

1.4.2 埋线组 参考《实验针灸学》[5]对大鼠的腧穴百会与大椎进行定位，局部脱毛，并用龙胆紫进行定标，分别在建模成功后的4个时间节点(即第1天、7天、14天和21天)进行穴位埋线，埋线时将规格为4-0的迪棕系胶原蛋白线(江西龙腾生物高科技有限公司，产品标准号：YY1116-2010)剪为10 mm/段，使用7#一次性埋线针进行相关操作。具体方法：两人配合，一人左手固定大鼠头颈部，右手固定大鼠后肢，另一人穿刺埋线。龙胆紫定标，穴位处备皮，穴位附近皮肤消毒，l%利多卡因皮内麻醉。羊肠线放置于埋线器套管内，快速刺入大椎穴与百会穴。左手拇、食指绷紧或捏起进针部位皮肤，右手持针刺入到所需深度后，先稍稍后退针，然后将线体弹入穴位，出针后用消毒干棉球按压止血。一穴一针进行埋线。

1.5 处死及取材

在干预的第28天，认知行为学实验完成后，对所有存活的大鼠进行处死取材。麻醉大鼠的方法为10%的水合氯醛5 mL/kg腹腔注射，当麻醉起效后，将大鼠用橡皮筋固定于自制的简易手术板上并放到解剖盘中，开腹、灌注和断头，取海马、剥离，放置于4%的多聚甲醛溶液，并放入4℃冰箱中过夜。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 制模成功率估算 根据各组大鼠在建模期间的Racine评分情况进行制模成功率估算。

1.6.2 癫痫发作程度及平均发作时间 干预后第28天，按照Racine分级评定方法，对所有存活大鼠进行时长为1 h的癫痫发作程度评估，并记录各组大鼠癫痫平均发作时间。

1.6.3 拒俘反应实验 干预前(即建模成功后)及末次干预后(干预第28天)，分别对各组大鼠进行拒俘反应性实验。具体方法为：以大鼠从未接触过的手套轻抓各组大鼠，观察其反应。记分标准见表2。

表2 拒俘反应实验记分标准

1.6.4 尼氏染色 将石蜡切片标本常规脱蜡至水后,于尼氏染色液中染色5 min，蒸馏水冲去浮色，依次用 70%、80%、95%及100%的酒精进行梯度脱水；入二甲苯中透明2次, 每次5 min，最后用中性树胶封片[6]，在Olympus 光学显微镜下观察并半定量评价CA1区的神经细胞丢失程度。评分标准见表3。

表3 尼氏染色评分标准

1.6.5 免疫组化法测定海马BDNF蛋白的表达 将石蜡切片脱蜡复水，DAB显色，进行脱水、透明和中性树胶封片处理，每张切片于光镜(400×)下随机挑选4个视野拍照，经Image-Pro Plus6.0软件处理后，对BDNF的阳性表达情况进行半定量分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 建模成功率

在建模过程中，模型组建模成功的大鼠为17只，其中2只因未达到点燃标准而被弃用，1只因癫痫持续状态造成死亡；西药组建模成功的大鼠为19只，1只因灌胃中出现误吸而致死；埋线组建模成功的大鼠为18只，有2只因未达到点燃标准而被弃用。本次实验中，共计60只大鼠参与实验点燃，有54只被成功点燃，经计算本次建模的成功率达到了90.0%。

2.2 各组癫痫发作程度及平均发作时间比较

Racine分级评分显示，模型组的大鼠可出现典型癫痫发作征象(P<0.01)；西药组、埋线组与模型组大鼠相比较，其癫痫发作程度明显减轻，平均癫痫发作时间亦明显减少(P<0.05)；而将西药组与埋线组进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组癫痫发作程度及平均发作时间比较

2.3 各组拒俘反应实验比较

通过拒俘反应实验评分可知，相较于空白组，模型组的大鼠攻击行为和逃避行为明显增多(P<0.01)；西药组、埋线组较模型组大鼠攻击行为和逃避行为显著减少(P<0.05)；而将西药组与埋线组进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 各组拒俘反应实验评分比较

2.4 各组尼氏染色结果比较

图1示尼氏染色后，空白组的海马区可见大量神经细胞，排列致密，形态正常，胞浆内有丰富的尼氏小体，未见核固缩等神经元变性受损特征。与空白组进行比较可知，模型组神经细胞数目明显减少，排列稀疏，细胞形态不正常，胞浆内尼氏小体减少，神经元受损特征明显。埋线组与西药组神经元受损程度较模型组轻，但在组织形态上与空白组仍有一定差距。

表6反应的是各组镜下半定量评分情况。可见空白组光镜下CAl区的神经细胞丢失程度半定量评分为0分，基本无损害，模型组、西药组、埋线组的评分显示有不同程度的损伤。与空白组比较，模型组评分显著上升(P<0.01)；与模型组相比，西药组、埋线组评分显著下降(P<0.05) ，而两组间比较则差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 尼氏染色后结果比照(400×)

图2 各组免疫组化下BDNF表达(400×)

表6 各组CA1区神经细胞丢失程度光镜下半定量分析评分

2.5 各组海马BDNF蛋白表达比较

通过图2可知，与空白组比较，模型组大鼠海马BDNF免疫阳性细胞着色明显，突起的染色加深，高倍视野下模型组大鼠海马BDNF阳性细胞表达数目为(16.85±3.49)个，明显少于空白组的(30.57±2.14)个(P<0.05)；经西药及穴位埋线干预后海马中BDNF表达均较模型组增高(P<0.05)，其中埋线组BDNF阳性细胞表达数目(24.23±2.29)个，西药组(25.57±2.23)个，而西药组与埋线组组间比较则差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

脑神经元的高度同步化异常放电会引起癫痫，导致神经元的丢失或者神经细胞的损害[6-9]。而神经元的缺失不仅仅会加重癫痫发作的严重程度[10]，更会导致认知功能障碍。本实验所选用的氯化锂-匹罗卡品建造癫痫大鼠模型的方法是目前学术界公认的与人类颞叶癫痫具有相似特征的致痫鼠模型[11-12]，长期反复发作的-颞叶癫痫可引起认知障碍[13]。大脑中主要参与学习、记忆等认知功能形成的部位是海马[14]，该部位是癫痫对认知功能影响的理想部位。

拒俘反应实验可以用于测评大鼠的认知情感行为；尼氏染色则可以直观观察海马相应区域的神经元丢失及损伤的程度。根据本次实验结果可知，氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠的自发性癫痫会有反复发作的倾向，可以引起大鼠学习记忆能力的减退；根据尼氏染色及镜下半定量评分结果可知，癫痫会引起大鼠的海马区神经元大量丢失并导致其学习记忆能力的下降，这与文献报道一致，由此证明实验模型复制成功。有研究表明，BDNF可能直接参与调节学习记忆等认知功能，本实验的免疫组化结果表明，埋线组与西药组的BDNF蛋白表达较模型组明显增加，提示穴位埋线可以减少神经元丢失程度、提升海马中BDNF蛋白的含量，进而可以改善癫痫后认知情况。

中医经络理论认为，癫痫的病机主要是督脉经气阻滞、气血逆乱，治宜醒脑开窍、平衡阴阳。督脉被认为是“阳脉之海”，对整个经络、气血均具有调节作用。百会穴为治疗癫痫的要穴[15-17],中医学认为头为“诸阳之会”“诸经皆通于脑”。百会穴位于巅顶，其深处即为脑之所在，为调节脑部功能之要穴，穴性属阳，又于阳中寓阴，为百脉之会，贯达全身，系平衡阴阳之要穴，配合“大椎穴”可增强疏通经络、行血化滞和调节督脉气机之功效，既可熄风宁神、缓解癫痫症状，又可开窍醒脑、改善认知状况。

纵观整个操作流程，穴位埋线集合了包括针刺、刺血、留针与穴位封闭等在内的中医多种刺激反应[18-21]。这些反应相互配合,共同起效,可以形成一种非特异性刺激冲动，此种冲动持久柔和而复杂,一部分抑制脏腑内作用，一部分通过神经-体液调节来调整脏腑，最终达到治愈疾病的作用[22]。穴位埋线使得癫痫及癫痫后认知损害有了方便而有效的治疗方法。

穴位埋线能克服癫痫发作时不易针灸的弊端，且操作治疗无需每日均进行，可减轻患者疼痛感与紧张感，安全且几乎无副作用；埋线百会还能起到脑保护的作用，对癫痫后认知障碍有改善作用。

总之，使用“大椎”“百会”穴位埋线疗法，可以减少海马神经元损伤，进而改善癫痫大鼠认知状况，但其具体作用的靶点尚待进一步研究。