贵州天麻主要挥发性成分的生物信息学分析

金继华，李专，杨欣，尹艾荟，杨玲燕，刘娇

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

中药及复方的多成分导致其分子机制复杂，但是中药及复方在疾病中的应用广泛，所以需要引进新技术解决中药成分的复杂性[1]。目前，网络药理学在系统生物学的基础上快速发展起来。从靶点、通路和疾病筛选等多方面揭示中药及复方治病机理[2-3]，也减少了实验的工作量及科研经费，同时为动物实验及细胞实验提供数据参考。

天麻(GastrodiaelataBl.)为名贵中药材，临床应用广泛，分布我国云南、贵州、四川及陕西等地。具有镇静、抗炎、抗惊厥和抗衰老等药理作用[4]。目前，天麻化学成分的研究逐渐清晰，主要有酚类、有机酸类、含氮类、糖类及挥发性成分[5]，但是天麻挥发性成分药理作用的研究报道较少。因此，本研究采用Swiss Target Prediction对天麻挥发性成分进行筛选，采用R软件对靶点进行GO和通路分析。通过Cytoscape3.5.1中的cytoHubba输出Hub基因。

1 实验材料及方法

1.1 数据库及软件

Cytoscape3.5.1(http：//www.cytoscape.org)；STRING(https://string-db.org/)；R(https://www.r-project.org)；Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)。

1.2 天麻主要挥发性化学成分靶点筛选

通过文献查找，对天麻挥发性成分相对含量大于5%进行统计[6-7]。天麻主要挥发性成分的靶点筛选基于Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行筛选，种属设置为“人源”，其他参数默认，预测小分子的靶点[8]。

1.3 GO富集分析

差异基因的基因本体论(Gene Ontology,GO)分为生物过程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)和细胞组成(Cellular Component)三个部分。使用R中clusterProfiler包进行GO富集分析。clusterProfiler支持3个物种(人类、小鼠和酵母)，本研究选择人源，根据差异基因的ID号进行分析[9]。

1.4 通路分析

使用R软件(ggplot2、clusterProfiler、enrichplot等)明确靶点参与的代谢通路名称。设定种为人源，选择P-value<0.01为阈值。同时使用R语言ggplot2包绘制通路气泡图，可以直观的展示P-value、pathway和count之间的关系[10]。

1.5 核心靶点分析

Hub基因是具有代表性的一些基因，通过Cytoscape软件中的CytoHubba模块识别hub靶点。其提供11中拓扑分析方法，本研究基于连接度(Degree)、最大邻居组件(Maximum neighborhood component，MNC)、应力(Stress)、边过滤成分(Edge Percolated component，EPC)四种算法输出Hub基因[11-13]。

2 结果

2.1 天麻挥发性成分及靶点筛选

通过文献共筛选出十六酸、亚麻酸、反式角鲨烯、甲氧基乙酸酐、3-糠醛和5-甲基呋喃醛为天麻主要挥发性成分,见表1。通过Swiss Target Prediction共筛选出242个潜在靶点。

表1 天麻主要挥发性成分(相对含量>5%)

2.2 靶点GO分析

2.2.1 潜在靶点生物过程分析

对242个靶点进行生物过程分析见表2。图1为242个差异基因的生物过程前10项(P-value<0.01)，在生物过程中，242个靶点主要参与类固醇激素反应、类固醇代谢过程、类固醇激素介导的信号通路、细胞对类固醇激素刺激的反应、细胞内受体信号通路、细胞钙离子稳态等。

注：GeneRatio：差异基因中与该Term相关的基因数与整个该Term的总基因数的比值；P-value:富集分析统计学显著水平，设置P-value<0.01；P.adjust：矫正后的P-value。图1 潜在靶点生物过程分析

表2 潜在靶点生物过程分析

2.2.2 潜在靶点细胞成分分析

对242个靶点细胞成分分析见表3。图2为242个差异基因细胞成分分析的前10项(P-value<0.01)，在生物过程中，242个靶点主要存在突触后膜、突触膜和RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物等。

注：GeneRatio：差异基因中与该Term相关的基因数与整个该Term的总基因数的比值；P-value:富集分析统计学显著水平，设置P-value<0.01； P.adjust：矫正后的P-value。图2 潜在靶点细胞成分分析

表3 潜在靶点细胞成分分析

2.2.3 靶点分子功能分析

对242个靶点进行分子功能分析见表4。图3为242个差异基因分子功能的前10项(P-value<0.01)。在生物过程中，242个靶点主要参与类固醇激素受体活性、核受体的活动、转录因子活性等分子功能。

表4 靶点分子功能分析

2.3 靶点通路分析

对242个靶点进行通路分析见表5。图3为242个差异基因的生物过程前10项(P-value<0.01)。在通路分析中，242个靶点主要参与花生四烯酸代谢、钙信号通路、炎症介导的TRP通道的调节和PPAR信号通路等。

表5 潜在靶点通路分析

注：GeneRatio：差异基因中与该Term相关的基因数与整个该Term的总基因数的比值；P-value: 富集分析统计学显著水平，设置P-value<0.01; P.adjust：矫正后的P-value。图3 靶点分子功能分析

2.4 Hub靶点分析

通过 Cytoscape3.5.1中的CytoHubba中的Stress、Degree、MCC和MNC四种算法输出前15个Hub基因,见表6;通过取交集的方法获取11个Hub靶点(IL6、MAPK3、MAPK1、EGFR、PTGS2、CNR1、PPARG、PIK3CA、ESR1、GRM5和MAPK14),详见图5。

表6 Hub靶点筛选

注：GeneRatio：差异基因中与该Term相关的基因数与整个该Term的总基因数的比值；P-value:富集分析统计学显著水平，设置P-value<0.01；P.adjust：矫正后的P-value。图4 靶点通路分析

图5 Hub靶点筛选

2.5 Hub靶点疾病分析

通过DAVID对11个Hub靶点进行疾病分析(P-value)，发现11个Hub靶点主要在肿瘤(食道癌、结直肠癌、上皮性卵巢癌、乳腺癌)、2型糖尿病和精神分裂症等疾病中发挥作用,见表7。

表7 关键靶点疾病分析

3 讨论

天麻是名贵中药材，药理作用广泛，主要涉及到心血管系统、神经系统，具有增强免疫力、抗炎等多方面作用[14]。目前，对天麻物质基础的深入研究，使其化学成分越来越清晰。但是其化学成分药理作用的相关靶点尚不明确，如果采用实验验证要耗费大量的时间、经费等,需要引入新的方法对其活性成分进行深入研究，因此本研究通过网络药理学分析对天麻主要挥发性成分进行靶点筛选、通路分析、GO富集分析，最后筛选11个Hub靶点(IL6、MAPK3、MAPK1、EGFR、PTGS2、CNR1、PPARG、PIK3CA、ESR1、GRM5和MAPK14)。主要在肿瘤(食道癌、结直肠癌、上皮性卵巢癌)和精神分裂症、2型糖尿病等疾病中发挥作用。已经有研究表明，天麻在改善学习记忆、抗抑郁等神经、精神药理方面均显示良好的作用。天麻能对神经方面的基本具有一定的疗效，如改善睡眠质量、脑供血不足等[15-16]；同时现代药理实验已证明，天麻多糖、天麻复方(半夏白术天麻汤)在抗肿瘤、糖尿病中也发挥重要[17]。

综上所述,已经有研究表明天麻在精神疾病、糖尿病和肿瘤中发挥作用，但是其发挥药效的物质基础尚未在天麻挥发性成分中报道，所以本研究初步明确天麻主要挥发性成分可能在肿瘤、精神疾病、糖尿病中发挥作用，还需要体内实验进一步验证分析。