针灸“肺俞”“大椎”“风门”对哮喘模型大鼠肺组织中嗜酸性粒细胞凋亡的影响

郑洁，邵素菊,2*，何竹青

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450008)

支气管哮喘[1](简称哮喘)是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。世界各国支气管哮喘流行病学调查结果显示[2]，成人哮喘患病率为1.2%～2.5%。随着全球经济的不断发展，哮喘的发病率逐年增高，给人类的身心健康带来巨大威胁。哮喘的病因病机复杂，至今尚未完全清楚，其中气道慢性炎症在哮喘发病过程中起重要作用，EOS是导致支气管哮喘气道炎症的主要炎性细胞之一[3]，其凋亡不足或延迟使气道内EOS大量浸润，加重气道炎症，参与哮喘发作。本实验所选取的肺俞、大椎、风门，是全国名老中医邵经明教授总结出的防治肺系疾病的有效腧穴[4-5]。笔者在邵老的研究基础上，以这3个穴位为主治疗肺系疾病开展了多项临床研究[6-8]，均证实了其有效性与安全性。本实验通过建立大鼠哮喘模型，观察针灸对哮喘模型大鼠肺组织中嗜酸性粒细胞凋亡的影响，以探讨针灸治疗哮喘的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只健康雄性SPF级SD大鼠，体质量180～220 g，购置于河南省实验动物中心,许可证号：SCXK(豫)2017-0001，饲养于河南中医药大学动物实验中心。

1.2 试剂及仪器

卵蛋白(北京索莱宝科技有限公司)；氢氧化铝干粉(上海麦克林生化科技有限公司)；水合氯醛(上海麦克林生化科技有限公司)；苏木素-伊红染色试剂(武汉赛维尔生物科技有限公司)；嗜酸性粒细胞染色液(北京雷根生物技术有限公司)；4%多聚甲醛、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、抗荧光衰减封片剂(大连美仑生物技术有限公司)。

一次性毫针(“中研太和”，0.30 mm×13 mm，天津亿朋医疗器械有限公司)；艾条(0.7 cm×12 cm，湖香艾生物科技有限公司)；压缩式雾化器NE-C30(大连欧姆龙有限公司)；万分之一电子天平BSA124S-CW、生物显微镜BA210、OLYMPUS荧光显微镜及成相系统U-RFL-T(河南中医药大学实验中心提供)。

1.3 模型建立

参考相关文献中有关大鼠哮喘模型的制备[9]。在实验第1天和第8天，模型组和各治疗组大鼠腹腔注射1 mL 10%复合卵蛋白溶液致敏，空白组用1 mL 0.9%氯化钠溶液代替。从实验第15天开始，将大鼠置于自制雾化吸入箱内，模型组和各治疗组大鼠雾化喷入1%卵蛋白溶液20 min激发哮喘，每日1次，共7次。空白组用0.9%氯化钠溶液代替激发20 min。以大鼠出现呼吸加快，抓耳挠腮，烦躁不安，打喷嚏，严重者出现四肢瘫软，行动迟缓或俯伏不动，紫绀等症状；连续激发后大鼠毛色变暗，失去光泽，反应迟钝，即为造模成功。

1.4 实验方法

将大鼠在适宜温度、湿度和通风良好的环境中适应性饲养5 d，用计算机统计软件产生随机数字表，将40只大鼠随机分为空白组、模型组、针刺组、艾灸组，每组10只。针刺组从实验第15天起，针刺大鼠“肺俞”“大椎”“风门”3穴，其中“肺俞”直刺6 mm、“大椎”直刺5 mm、“风门”直刺6 mm，3穴均采用平补平泻手法，每10 min行针1次，留针20 min，起针后激发20 min，每日1次，共针刺7次；艾灸组从实验第15天起，在距离“肺俞”“大椎”“风门”3穴上方2～3 cm处行悬灸10 min，灸毕激发20 min，每日1次，共艾灸7次；模型组按前面造模方法造模；空白组按照造模方法用0.9%氯化钠溶液代替卵蛋白。模型组与空白组每天均给予相同的抓握刺激，不做任何治疗，每日1次，共7次。

1.5 标本取材

末次治疗24 h内，在大鼠腹腔内注射10%水合氯醛，待大鼠麻醉后，75%酒精消毒胸部皮毛，打开胸腔，暴露肺及心脏，摘取右肺中叶组织，立即用0.9%的生理盐水冲洗干净，然后迅速放入4%多聚甲醛中固定1周，4 ℃保存，切片待测。

1.6 指标检测及方法

1.6.1 HE染色法观察肺组织病理形态

62 ℃烤片30 min，二甲苯脱蜡：二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min、二甲苯Ⅲ 10 min，梯度乙醇水化：无水乙醇Ⅰ3 min、无水乙醇Ⅱ3 min、95%酒精Ⅰ3 min、95%酒精Ⅱ3 min、90%酒精3 min，苏木素染色5 min，1%盐酸酒精分化2～3 s，肥皂水反蓝15 min，伊红染色8 min，梯度乙醇脱水：80%酒精1 min、90%酒精1 min、95%酒精Ⅰ1 min、95%酒精Ⅱ1 min、无水乙醇Ⅰ3 min、无水乙醇Ⅱ3 min，二甲苯透明：二甲苯Ⅰ2 min、二甲苯Ⅱ2 min，中性树胶封片。光学显微镜下观察各组大鼠肺组织病理形态学变化。

1.6.2 标记嗜酸性粒细胞的组化染色法测量嗜酸性粒细胞总数

将HE染色步骤中苏木素染色15 min、伊红染色8 min换为Lea苏木素染色1 min、Carbol 2R染色15 min，其他步骤同前。显微镜下观察嗜酸性粒细胞核为蓝色，通常2～3叶，细胞质内充满粗大、均匀的砖红色或鲜红色颗粒，大多数分布于支气管与血管周围的肺间质中，少量分布于肺泡。每张切片随机取5个视野，计数嗜酸性粒细胞总数，取平均值为该切片代表值。

1.6.3 TUNEL法检测嗜酸性粒细胞凋亡率

62 ℃烤片1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，滴加Proteinase K(用PBS按1∶100比例稀释)于肺组织37 ℃孵育30 min，暗室中滴加TUNEL检测液[TdT Enzyme(10×)]与FITC-12-dUTP Labeling Mix按1∶9比例混合)于肺组织37 ℃孵育60 min，暗室中滴加抗荧光衰减封片剂封片。在HE染色的同一视野中计数凋亡的嗜酸性粒细胞数，取每张切片5个视野的均值为该切片代表值。

嗜酸性粒细胞凋亡率(%)=凋亡的嗜酸性粒细胞/嗜酸性粒细胞总数×100%

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理形态学观察

空白组大鼠肺组织形态结构正常，支气管管腔规则，支气管及肺间质内未见炎性细胞浸润；模型组大鼠支气管管腔明显缩窄，气道黏膜水肿，平滑肌及周围血管肥大增厚，支气管及肺间质内有大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润；针刺组与艾灸组大鼠支气管管腔略增厚，气道黏膜轻度水肿，支气管及肺间质内有少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理形态变化(HE染色，×400)

2.2 各组大鼠肺组织内EOS计数比较

与空白组相比，模型组大鼠肺组织内EOS计数明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，针刺组、艾灸组大鼠肺组织内EOS计数明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)；针刺组与艾灸组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和图2。

表1 各组大鼠肺组织内EOS计数比较个)

图2 各组大鼠肺组织内EOS表达(标记嗜酸性粒细胞的组化染色法，×400)

2.3 各组大鼠肺组织内EOS凋亡率比较

与空白组相比，模型组大鼠肺组织内EOS凋亡率明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，针刺组、艾灸组大鼠肺组织内EOS凋亡率明显增高，差异均有统计学意义(均P<0.01)；针刺组与艾灸组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和图3。

表2 各组大鼠肺组织内EOS凋亡率比较

图3 各组大鼠肺组织内EOS凋亡率比较(TUNEL法，×400)

3 讨论

气道慢性炎症目前被认为是哮喘的基本病理改变和反复发作的主要原因。在哮喘的病理过程中，有嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞等多种炎性细胞在气道内浸润和聚集，其中EOS浸润是气道炎症发生的重要环节。当EOS活化、坏死时，释放多种毒性蛋白，合成各种细胞因子和炎性介质[10]，引起上皮脱落，血浆外渗，基底膜增厚，平滑肌细胞增殖，从而损伤气道上皮，降低气道防御功能；并可激发自身和其他细胞释放更多的细胞因子，从而加重气道炎症。所以减少气道内EOS浸润，有助于气道炎症消退。相关研究证实[11-13]，哮喘模型大鼠肺泡灌洗液、静脉血、肺组织中EOS水平均高于对照组。

细胞凋亡[14]是1972年病理学家Keer等首先提出，它是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程，最后细胞脱落离体，或者裂解成凋亡小体，被其他细胞吞噬。EOS是哮喘发生过程中最重要的炎症细胞，其在肺内浸润募集与其凋亡失衡有关。EOS凋亡后，被巨噬细胞吞噬，从而防止细胞内毒性物质释放，有利于炎症消退，减轻哮喘症状。戴绍文等[15]对哮喘患者行支气管激发试验后，患者外周血和痰液中EOS凋亡率明显下降，并且哮喘组患者EOS凋亡率显著低于对照组。王明明[16]观察到幼龄哮喘豚鼠肺泡灌洗液中存在EOS凋亡不足的现象。吴兆利等[17]研究发现，哮喘大鼠肺组织中EOS凋亡指数远远低于对照组，针刺“足三里”穴后，可以促进EOS凋亡，减轻哮喘炎性反应。因此提高EOS凋亡可以减轻炎症发生，缓解哮喘；当气道中EOS凋亡受抑制，炎症发生则加快，从而加重哮喘。

哮喘属“哮病”“喘证”的范畴，其病因病机复杂，但总结起来不外乎宿痰潜伏于肺，每遇风、寒、湿等六淫外邪之侵袭；或情志失调，或饮食不节，或劳欲久病等，使脏腑功能失调，痰浊内生，壅塞气道，哮喘而发。本实验选取邵老治疗哮喘经验要穴，即肺俞、大椎、风门。肺俞位于足太阳膀胱经，为肺脏精气输注之处，是治疗肺疾的重要腧穴，有调理肺脏、止咳平喘之功。邵老通过三因素二水平正交试验[18]，证实了三穴平喘作用以肺俞为最佳，从而使肺俞上升为第一主穴。大椎位于督脉，为手足三阳经与督脉之交会穴，被称为“诸阳之会”，具有统摄全身阳气的功能，针之可温阳散寒、降逆平喘。张伟等[19]报道悬灸大鼠“大椎”穴可降低NGF、SP、CGRP、NKA等含量，从而降低神经源性反应，缓解哮喘气道炎症。风门位于足太阳膀胱经，因其为风邪出入之门户而得名，乃搜风要穴。针之穴可疏风解表、宣肺平喘。三穴合用，哮喘发作期可宣肺理气、平喘降逆；缓解期可扶正祛邪、补益肺气。

本研究观察针灸“肺俞”“大椎”“风门”3穴对哮喘模型大鼠肺组织中EOS凋亡的影响，结果显示，针刺组与艾灸组大鼠肺组织内EOS凋亡率明显高于对照组，EOS总数明显低于对照组，说明针刺与艾灸均可以通过诱导EOS凋亡，减轻EOS在气道的浸润，从而控制哮喘炎症反应。