5-HT2A受体对七氟醚或丙泊酚麻醉联合Aβ1-40诱导的大鼠术后认知障碍的影响*

2021-03-03 10:57希尔娜衣艾孜买提马海平
广西医科大学学报 2021年1期
关键词:单侧象限海马

希尔娜衣·艾孜买提,杨 龙,马海平

(新疆医科大第一附属医院麻醉科,乌鲁木齐 830054)

心脏手术患者术后较易出现中枢神经系统并发症[1-2],最常见的就是术后认知功能障碍(postoper‐ative cognitive dysfunction,POCD)。POCD 表现为术后记忆力减退、注意力不集中和定向能力低等,其发病机制目前尚未阐明[3]。七氟醚(sevoflurane,Sevo)和丙泊酚(propofol,PRO)是临床上应用较为广泛的全麻药物,其中Sevo在临床上是用于诱导麻醉的吸入型麻醉药[4],PRO 是静脉麻醉药物。研究表明,七氟烷和PRO 均会对大鼠认知造成一定的损伤[5-6]。目前认为,诱发POCD 的主要原因为麻醉药的使用,包括Sevo用于麻醉的诱导和维持危重患者的镇静等[4]。PRO可改变海马Tau蛋白磷酸化水平,而导致POCD 的发生[5-6]。五羟色胺(5-hydroxytryp‐tamine,serotonin,5-HT)是一种有效的神经保护剂,研究表明,5-HT 受体在认知的调控中发挥重要作用[7]。但5-HT2A 受体激动剂对改善认知功能障碍的作用仍不清楚。本研究旨在探讨5-HT2A 受体激动剂[1-(2,5-dimethyl-4-iodophenyl) -2-aminopro‐pane,DOI]对Sevo 和PRO联合Aβ1-40诱导的大鼠POCD的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与主要试剂 Sevo(江苏恒瑞医药股份有限公司,国药准字H20040772);PRO(四川蜀乐药业股份有限公司,批号0405027);DOI(美国sigma 公司)。戊巴比妥钠(美国sigma 公司)。原位细胞死亡检测试剂盒(德国罗氏诊断有限公司);山羊血清(北京阳光生物科技);兔抗鼠5-HT2A 受体一抗和山羊抗兔IgG H&L(美国Abcam公司)。

1.2 实验动物 4 个月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,SPF 级,体重416~477 g,购自新疆医科大学动物实验中心,动物生产许可证号:SCXK(新)2019-0003,使用许可证号:SYXK(新)2019-0015。本研究动物实验均通过新疆医科大学动物伦理委员会批准。动物饲养于(24±2)℃和40%~70%相对湿度的通风笼中,每24 h 一个明暗循环(06:00~18:00明、18:00~06:00暗),自由摄食和饮水。

1.3 动物分组与处理 将50 只大鼠随机分为5 组(n=10),即假手术组、Sevo-POCD 组、PRO-POCD组、DOI+Sevo-POCD 组、DOI+PRO-POCD 组。将5组大鼠分别置于相应的恒温玻璃容器内,并使其保持自主呼吸。(1)假手术组:由进气孔通入正常空气(流速为2 L/min),腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg),在海马区注射2 μL 生理盐水;(2)Sevo-POCD组:通入流速为1 L/min 的氧气+1 L/min 空气+3.4%Sevo 进行麻醉(德尔格Fabius Plus 型麻醉机),随后海马区注射2 μL Aβ1-40(5 μg/μL)诱导POCD;(3)PRO-POCD组:由进气孔通入正常空气(流速为2 L/min),按100 mg/kg 剂量腹腔注射3 mL PRO 进行麻醉,随后海马区注射2 μL Aβ1-40;(4)DOI+Sevo-POCD 组:在Sevo-POCD 组处理基础上立即一次性静脉注射0.5 mg/kg 的DOI;(5)DOI+PRO-POCD组:在PRO-POCD 组处理基础上立即一次性静脉注射0.5 mg/kg的DOI[8-9]。1次/d,连续5 d。

1.4 Morris 水迷宫实验评估大鼠认知功能 每组处理完24 h 后,连续进行7 d 的水迷宫测试,其中包括隐藏平台测试和空间探索测试。(1)隐藏平台测试:水迷宫以池底圆心为中心等分为4个象限,分别表示为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限。平台放置于目标现象(第Ⅱ象限)。将大鼠从面对泳池壁从每个象限中放入水中,游泳90 s 以找到隐藏平台。逃避潜伏期为在池中定位隐藏平台所需的时间。若在90 s后未找到平台,则将大鼠定向到平台,并将分数计为90 s。前4 d用于训练。排除得分为90 s的大鼠,将第5天的测试得分记录为动物的空间学习和记忆的得分。(2)空间探索实验:在隐藏平台测试结束24 h 后将平台移开。将大鼠置于与以前相同的水中,记录其游泳路径60 s。记录大鼠在第Ⅱ象限停留时间和穿越平台的次数。记录大鼠的轨迹,并使用莫里斯水迷宫视频分析系统(WMT-100S,Taimeng)进行信息处理。

1.5 神经功能评分[10]在建模后的第3 天,使用Garcia评分法评估实验动物的神经功能。(1)动物的活动范围:无移动(0分),乎不能移动(1分),活动范围少于笼子3 个面(2 分),活动范围大于等于笼子3 个面(3 分);(2)四肢动作对称性:单侧不活动(0 分),单侧可轻微活动(1 分),单侧肢体活动对侧有轻微动作(2分),两侧动作对称(3分);(3)前肢运动对称性:单侧不能运动(0分),单侧仅轻伸(1分),可运动单侧稍弱(2分),前肢对称伸展(3分);(4)金属笼中攀爬能力:无动静(0分),几乎无攀爬(1分),有攀爬,单侧稍弱(2 分),正常攀爬(3 分);(5)触摸身体两侧和触须反应:无(0分),单侧无反应(1分),单侧反应弱(2分),有对称的反应(3分)。动物机能正常时最高评分为18 分,其中笼里自由活动5 min、四肢动作对称性、前肢运动对称性、金属笼中攀爬能力、触摸身体两侧的反应、触须反应这6 项各得3分。

1.6 苏木精-伊红(HE)染色法观察大鼠海马组织病理学变化 所有测试完大鼠1 周后以断颈法处死,分离完整脑组织,并剥离海马组织,使用福尔马林固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋,4 μm 连续切片,二甲苯脱蜡;苏木精染色5 min,PBS洗涤,伊红染色30 s,梯度酒精脱水,中性胶封片,光学显微镜下观察海马组织病理变化。

1.7 TUNEL 测定神经元细胞凋亡率 使用原位细胞死亡检测试剂盒,将石蜡包埋的海马组织5 μm切片用二甲基苯脱蜡两次,每次10 min,通过梯度渗透洗脱酒精;置于37 ℃湿润暗箱中用50 μL TUNEL反应溶液处理60 min。显微镜下随机选取10 个视野,观察并记录棕色核的数目。计算海马CA1 区TU‐NEL阳性核(棕色)的百分比。

1.8 免疫荧光法检测5-HT2A受体蛋白表达 海马组织切片置于3%过氧化氢溶液中浸泡15 min,PBS洗涤,柠檬酸钠溶液进行抗原回收;山羊血清室温下封闭30 min,弃血清,加入5-HT2A 受体抗体(1∶100),4 ℃冰箱孵育过夜;PBS 洗涤,山羊抗兔IgG H&L 抗体(Cy3,1∶200)室温下孵育30 min,PBS洗涤;添加DAPI染料10 min,PBS洗涤,中性树胶密封,荧光显微镜下观察。使用Image J软件分析光吸收值。

1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,随后进行多重比较检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠认知功能情况 与假手术组比较,Sevo-POCD 组和PRO-POCD 组逃避潜伏期延长,在第Ⅱ象限停留时间缩短,穿越平台次数减少(均P<0.05),Sevo-POCD 组与PRO-POCD 组比较,差异无统计学意义(P>0.05);DOI+Sevo-POCD 组逃避潜伏期短于Sevo-POCD 组,在第Ⅱ象限停留时间长于Sevo-POCD 组,穿越平台次数多于Sevo-POCD 组(均P<0.05);DOI+PRO-POCD 组逃避潜伏期短于PRO-POCD 组,在第Ⅱ象限停留时间长于PROPOCD 组,穿越平台次数多于PRO-POCD 组(均P<0.05),见表1。

表1 5组大鼠认知能力比较 ±s

表1 5组大鼠认知能力比较 ±s

与假手术组比较,aP<0.05;与Sevo-POCD 组比较,bP<0.05;与PRO-POCD组比较,cP<0.05。

2.2 神经功能评分 与假手术组[(16.00±0.00)分]比较,Sevo-POCD 组[(2.46±0.56)分]和PRO-POCD组[(3.18±0.42)分]Garcia 神经功能评分降低(P<0.01),而Sevo-POCD 组与PRO-POCD 组比较,差异无 统 计 学 意 义(P>0.05);DOI+Sevo-POCD 组[(9.23±0.80)分]Garcia神经功能评分高于Sevo-POCD组(P<0.05),DOI+PRO-POCD 组[(7.96±0.57)分]Garcia 神经功能评分高于PRO-POCD 组(P<0.05)。

2.3 大鼠海马组织结构变化 假手术组中,海马CA1 区神经元排列规则、紧密,具有清晰的细胞边界,且细胞形态规则,细胞核大而圆,细胞质丰富;其余4 组的海马区神经元细胞严重受损,细胞排列疏松紊乱,细胞间隙增大,细胞数目减少,细胞质减少,细胞核固缩严重,且细胞形态不规则,见图1。

2.4 大鼠海马组织凋亡情况 与假手术组比较,Sevo-POCD 组和PRO-POCD 组神经元细胞凋亡率升高(P<0.05),PRO-POCD 组与Sevo-POCD 组比较,差异无统计学意义(P>0.05);DOI+Sevo-POCD组神经元细胞凋亡率低于Sevo-POCD 组(P<0.05),DOI+PRO-POCD 组神经元细胞凋亡率低于PRO-POCD组(P<0.05),见图2。

2.5 大鼠5-HT2A 受体蛋白表达 与假手术组比较,Sevo-POCD 组和PRO-POCD 组的5-HT2A 受体蛋白表达下调(P<0.01);另外,DOI+Sevo-POCD 组的5-HT2A 受体蛋白表达高于Sevo-POCD 组(P<0.05);且DOI+PRO-POCD组的5-HT2A受体蛋白表达高于PRO-POCD组(P<0.05),见图3。

图1 大鼠海马CA1区组织HE染色(比例尺=50 μm,×400)

图2 TUNEL法检测大鼠海马CA1区神经元凋亡(×400)

图3 5-HT2A受体蛋白的荧光染色图

3 讨论

手术后出现中枢神经系统并发症,表现为精神错乱、焦虑、人格的改变以及记忆受损,被称为POCD。大型手术术后往往会表现出的POCD,包括记忆障碍,迷失方向和视觉空间能力,严重者可导致患者死亡和致残[11-12]。麻醉剂的使用已成为POCD 的关键因素。POCD 的发病率增加已阻碍了外科手术的发展。临床上,在Sevo 全麻下,患者的围手术期出现POCD 的概率明显增加;而PRO 作为常用的静脉麻醉药,起效和苏醒均较快,术后并发症出现的概率低,常用于麻醉的诱导和维持及危重患者的镇静。

Aβ沉积是各种原因诱发POCD 的共同途径,亦是POCD 形成和发展的关键因素[13]。研究表明,Se‐vo 可能对大鼠认知能力产生一过性影响,在1 周时间点为重要的节点,胆碱能系统发生紊乱,是造成POCD 的关键原因[8,14];而PRO 使海马Tau 蛋白磷酸化水平发生变化诱导POCD 的发生[15]。本研究在对大鼠进行Sevo 或PRO 麻醉分别联合大鼠海马区注射Aβ1-40诱导大鼠发生POCD。通过水迷宫实验本研究验证Sevo 麻醉联合注射Aβ1-40导致大鼠的逃避潜伏期延长,且目标象限(第Ⅱ象限)的停留时间和穿越平台次数均减少(P<0.05),而PRO 联合注射Aβ1-40得到类似的结果。表明Sevo 或PRO 麻醉联合Aβ沉积均可形成明显的POCD行为。

5-HT 已经被大量报道在抗抑郁和认知功能障碍中具有关键作用,而其5-TH2A 受体的在COPD中的作用则研究较少。尽管如此,仍有研究证实,在患有一般性和局部性脑缺血的动物模型中,5-HT2A 受体可以减轻脑损伤并改善功能恢复[16-17]。5-HT受体激动剂可以明显改善海马神经损伤,从而减轻认知功能障碍[18]。早期的报道显示,5-HT2A受体有益于激活海马胆碱能神经元[19],从而可能参与认知功能障碍的调节作用[8,20]。本研究中,大鼠海马区5-HT2A 受体在Sevo 或PRO 麻醉联合海马区注射Aβ1-40诱导POCD 大鼠中的表达明显下调(P<0.05)。表明5-HT2A 受体在POCD 发生过程中可能具有关键作用。

5-HT2A 受体激动剂处理后大鼠的逃避潜伏期明显缩短,第Ⅱ象限的停留时间和穿越平台次数均增加(P<0.05)。进一步使用Garcia 神经功能评分评估大鼠的神经功能改善情况。Sevo 或PRO 麻醉联合海马区注射Aβ1-40诱导诱导下大鼠的神经功能评分明显降低,笼内活动和攀爬能力,四肢动作对称性、前肢运动对称性、触须反应均表现较差(P<0.05)。注射5-HT2A 受体激动剂后,大鼠的运动能力、反应能力、左右协调性均明显改善(P<0.05)。研究结果表明,5-HT 受体可能是POCD 治疗中合适的药物靶标[21]。除中枢神经组织外,5-HT 受体在大鼠海马齿状回、下丘脑、大脑皮层、脊髓中均有表达。另外,由于海马区神经元的功能是学习和记忆的基础,POCD 的发生与海马神经元凋亡有显著相关性[13],在本研究中,使用Sevo和PRO 麻醉后,动物的神经元凋亡率明显升高(P<0.05),本研究证实,5-HT2A 受体激活可抑制大鼠神经元的凋亡并改善脑损伤,并可能基于此原因从而改善COPD 大鼠的认知功能障碍。

综上所述,5-HT2A 受体激动剂通过激活5-HT2A受体改善手麻醉剂联合Aβ1-40诱导的POCD大鼠的认知功能和神经功能紊乱并抑制神经元凋亡。本研究为麻醉剂为关键的诱因的POCD治疗提供了临床研究依据。

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