钛钽生物梯度材料在成骨过程中对碱性磷酸酶的影响

姜铭坤，何亚茹，吴文慧

（1.华北理工大学口腔医学院，河北 唐山 063000；2.唐山职业技术学院，河北 唐山 063000）

随着人们对生活质量要求的提高和医疗科技的高速发展，生物材料领域受到广泛重视。钛及钛合金材料具有力学性能良好、弹性模量低、易加工、抗腐蚀和生物相容性高等优点，被广泛的应用于人工骨、人工关节、骨钉、牙种植体等硬组织替代材料和心脏瓣膜、血管支架等血管材料[1]。有研究发现，材料植入体内后，会与骨组织结合[2]。由于钛表面存在氧化层，限制其与骨组织间形成理想的结合而具有生物惰性，影响植入体在体内的长期性；同时，复杂的人体内环境会腐蚀金属材料从而导致有毒元素释放[3]，生物相容性降低。因此，可在保留其原有优点的前提下，对钛及钛合金进行表面改性，有利于提高其多种性能，如生物相容性、抗菌性等，改善植入体的功效，延长植入体的使用寿命。

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是从哺乳动物的骨髓基质中发现的一种可分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的细胞亚群，研究其成骨方向的分化有重要意义。目前，BMSCs成骨分化的检测指标有多种，其中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织中的一种酶，在成骨过程中成骨细胞的活性增强时会分泌大量的ALP，是观察成骨情况最直观、有效的检测指标之一[4]。基于此，本研究选取光滑钛片、经酸蚀水热处理的钛片、经酸蚀水热处理后等离子喷涂钽的钛片作为研究对象，旨在探讨钛钽生物梯度材料在成骨过程中对碱性磷酸酶的影响，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取光滑钛片（光滑纯钛组）、经酸蚀水热处理的钛片（酸蚀水热组）、经酸蚀水热处理后等离子喷涂钽的钛片（钽喷涂组）作为研究对象，其中钽喷涂组作为实验组，光滑纯钛组、酸蚀水热组作为对照组，上述材料均由华北理工大学材料学院提供。

1.2 主要试剂和仪器 SD 大鼠第三代BMSCs（华北理工大学口腔医学院实验室提供），磷酸盐缓冲液（PBS，北京索莱宝科技有限公司），ALP 试剂盒（南京建成），细胞培养箱（Forma，美国），低速离心机（SC—3610，安徽），平底24、96 孔培养板（Corning，美国），酶标仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司）。

1.3 方法 将3 组钛片置于24 孔板中，每组设3 个复孔，细胞接种密度为2×104/孔。培养3、5、7 d 后，收集上清液，12 000 r/min离心15 min，取上清液并采用ALP试剂盒进行检测。①标准曲线绘制：试剂盒中的酶标准品贮备液用双蒸水稀释，分别稀释 50 倍、20 倍、10 倍、5 倍、2.5 倍、5/3倍和1.25 倍，每孔5 μL。加入缓冲液、基质液及显色剂250 μL，反应15 min后使用酶标仪在520 nm下检测OD值，绘制ALP标准曲线备用。②测定各组ALP活性：实验组于96孔板中每孔加入30 μL上清液，并加入缓冲液、基质液和显色剂共250 μL；空白组加入30 μL 双蒸水，并加入缓冲液、基质液和显色剂共250 μL。反应30 min 后酶标仪以波长520 nm下测定OD值，根据标准曲线计算ALP的含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以“”表示，采用单因素方差分析，组间比较采用F检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

第3 天，钽喷涂组与酸蚀水热组ALP 水平均明显高于光滑纯钛组；第5 天，钽喷涂组ALP 水平高于酸蚀水热组；第7天，酸蚀水热组与钽喷涂组ALP 水平差异缩小，但钽喷涂组仍高于酸蚀水热组（P＜0.05），见表1。

表1 试件表面细胞ALP活性（金氏单位/100 mL）Table 1 Surface cell ALP activity(Kim's unit/100 mL)

3 讨论

骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等细胞分化[5]。实验研究表明，BMSCs 经成骨诱导后，复合以适当的材料能异位成骨、修复骨缺损，且不存在免疫排斥反应，是具有广阔应用前景的种子细胞[6]。目前，BMSCs 成骨分化的检测指标有多种，其分化形成的成骨细胞分泌一种糖蛋白，即碱性磷酸酶是早期矿化的标志，通过检测ALP 的活性，可反映不同钛片材料对成骨分化的影响。

纯钛应用于口腔种植体时，具有良好的生物相容性、抗腐蚀性等优点，但也存在生物活性较低、骨整合周期长等不足。因此，人们对其进行改性处理，为提高纯钛表面的生物活性，缩短骨整合周期[7]。上述方法涉及物理、化学、生物化学等几大学科，具体有喷涂、大颗粒喷砂酸蚀（SLA）、等离子喷涂、溅射、离子注入、激光处理、紫外线处理、酸蚀处理、碱热处理、阳极氧化法、生物活性因子或仿生剂等内容，从微米水平的研究，逐步深入到纳米、微纳米级别。

本研究采用3组钛片，其中酸蚀水热处理组结合酸蚀处理和碱热处理两种方法。首先，使用HF和HNO3 两种酸性溶液1∶1 混合双重酸蚀的方法，形成微纳结构，具有微观的粗糙面，即可增加细胞与材料表面的接触面积，又可提高细胞材料表面的稳定性。然后，对钛片进行碱热处理，浸入仿生体液（SBF）。Lenka Jonášová 等[8]研究发现，经NaOH 处理的钛片再浸入SBF 后，可在表面形成碳酸氢盐-磷灰石层（HCA），但不均匀，而经酸蚀处理的纯钛片可形成均匀的微观粗糙面，促进HCA形成，再经过碱化处理，磷灰石晶核形成均匀，沉积的HCA 厚度会随着时间而增加[9]。结合两种处理方法的钛片表面，兼有微米级孔和纳米级结构，具有更高的粗糙度，促进骨生成作用较强[10]。

等离子喷涂是一种材料表面强化、表面改性的技术，可使基体表面获得耐磨、耐蚀、耐高温氧化、电绝缘、隔热、防辐射、减磨和密封等性能。当其应用于医疗领域时，可在人造骨骼表面喷涂一层10 μm 左右涂层，作为强化人造骨骼，加强亲和力的方法。在口腔医学领域，可作为涂层制备方法，用于种植体的表面改性[11]。目前，国内外对等离子喷涂羟基磷灰石（HA）进行较多的研究报道和临床试验，发现其具有无毒无害、耐腐蚀、耐磨耗、力学性能优良等特点，也存在包括涂层表面不均匀，涂层内含有杂质，涂层易出现裂隙，涂层密度不够，界面被腐蚀后易脱落等问题[12]。

金属钽（Ta）具有机械性能良好、化学性能稳定等优点，已成为重要的现代功能性材料，被称为“贵族金属”。在现代医学中，钽金属因耐腐蚀性和生物相容性的特点，引起了医疗和材料工作者的关注，在医疗领域广泛应用，如外科手术材料、颅骨修补、血管缝合等。特别是钽涂层，可提高金属钛的骨整合性能，增加细胞的粘附能力从而促进细胞生长，使金属钛获得更高的表面能和更好的润湿性，改善细胞与植入材料间的相互作用。

综上所述，3组不同处理钛片表面的ALP水平存在差异，钽喷涂组高于酸蚀水热组、光滑纯钛组，说明钛钽生物梯度材料有利于成骨，能提高ALP活性。这种新型钛片处理方法存在哪些不足、需要如何改进、能否推广使用，有待于今后进一步研究。