半胱氨酸蛋白酶抑制剂C对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮质caspase-9、脑红蛋白表达和过氧化损伤的影响*

陈 萌 梁秀军 吴晓光，5 马凯旋 陈元操

（承德医学院，1 基础医学院电镜室，2 基础医学院基础医学研究所，3 2016级临床本科，4 2014级临床本科，5 河北省神经损伤与修复实验室，承德 067000）

缺血性脑血管疾病对人类健康造成的危害日趋严重，寻找有效方法加强对缺血性脑血管疾病的防治尤为重要。缺血性脑卒中的主要病理过程是脑部缺血再灌注损伤。因此，改善脑缺血再灌注造成的损伤是亟需解决的问题[1]。脑红蛋白（neuroglobin，NGB）是一类球蛋白，这种蛋白主要存在于中枢神经系统的脑内神经元，它与脑内氧的运输、贮备和利用密切相关[2-4]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cysteinyl aspartate-specific protease-9，caspase-9）是位于caspase级联反应上游的启动性蛋白酶，与细胞凋亡的关系非常密切。研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（cystatin C，CysC）能在一定程度上降低缺血再灌注后神经元凋亡，对神经元的保护有较好的作用[5-7]。本实验通过给予药物CysC预处理脑缺血再灌注损伤的实验大鼠，研究其对损伤后大脑皮质组织caspase-9、NGB的表达及自由基损伤和形态学的影响，以期为脑缺血再灌注损伤的预防及治疗提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

CysC（purified）购自瑞士Enzo Life Science，（货号BML-SE479-0100，批号：12101509）；一抗兔抗caspase-9 单克隆抗体（美国Abcam 公司，货号ab-32539，批号：YH100912D）；兔抗NGB 多克隆抗体（美国 Proteintech 公司，货号：13499-1-AP）；Alexa Fluor®594 -羊抗兔IgG（美国Life Technologies，货号：A-11072）；兔SP 试剂盒（北京中杉金桥，兔链霉素卵白素-生物素法检测系统，货号SP-9001，批号：16183A03）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔 IgG（美国KPL，货号074-1506-50，批号：140012）；BCA法蛋白定量试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司，货号70-M-PQ0012，批号：4219150）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（南京建成，货号A001-1，批号：20170612）；丙二醛（malondialdehyde，MDA，南京建成，货号A003-1-100，批号：20170608）；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX，南京建成，货号A005-1，批号：20170612）；蛋白定量试剂盒购自南京建成（货号A045-2，批号：20170602）；石蜡切片机（德国Leica 公司，型号 RM2235）；超薄切片机（德国Leica 公司，型号 EM UC6）；倒置荧光显微镜（德国Leica，型号DMI4000B）；透射电子显微镜（日本Hitachi 公司，型号 H-7650）。

1.2 动物分组及模型建立

成年SPF级SD雄性大鼠，体质量220～250 g，购自北京维通利华生物技术有限公司。大鼠按照随机数字法分为假手术组（Sham），脑缺血再灌注组（I/R），CysC 低（2 mg/L）、中（5 mg/L）、高浓度组（10 mg/L），每组18只。大鼠适应性喂养1 周后，用10%水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg）。I/R组和CysC 各组参照Longa 法建立右侧局灶性脑缺血再灌注损伤模型[8]。Sham组仅分离右侧颈总、颈外和颈内动脉，不插入渔线。术后灯照保暖，缺血2 h拔出线栓至颈外动脉残端实现再灌注。

1.3 H-E染色观察形态学变化

再灌注24 h用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，每组取6只。先用生理盐水约300 mL 进行快速灌流，再用4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（200 mL）先快后慢进行全身灌流固定。取脑后置于4%多聚甲醛中后固定24 h。常规脱水，石蜡包埋后于石蜡切片机上进行连续冠状切片，片厚5 μm。常规脱水后行H-E染色，光镜下观察大鼠脑组织神经元的形态学变化。

1.4 免疫组织化学法检测caspase-9 阳性细胞数

包埋块于石蜡切片机中进行连续冠状切片，片厚5 μm。石蜡切片常规脱蜡水化后，3% H2O2室温15 min 灭活内源性过氧化物酶。取柠檬酸盐缓冲液加入微波盒中，加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于已沸腾的缓冲液中，中档处理10 min，取出自然冷却后用PBS 冲洗。滴加正常山羊血清室温封闭15 min弃去，勿洗。滴加兔抗caspase-9单克隆抗体（1∶200），4℃孵育过夜。次日取出室温放置30 min，洗片后滴加生物素标记山羊抗兔IgG，37℃孵育10 min。滴加辣根酶标记链霉卵蛋白工作液37℃孵育10 min。PBS 冲洗后DAB 显色，不同浓度的乙醇脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片。光镜下观察染成棕黄色颗粒的阳性细胞，各组分别于200倍视野下选取5个互不重叠视的区域进行拍照。计算阳性细胞数目，取其平均数。

1.5 免疫荧光染色检测NGB 阳性细胞

石蜡切片经二甲苯常规脱蜡后梯度乙醇水化，室温下加入0.25% Triton X-100 进行处理。PBS 摇洗后用蒸馏水浸泡切片5 min。切片在柠檬酸缓冲液中进行抗原修复，温度在95℃～98℃，时间20 min。切片在修复液中恢复至室温后取出，放置于PBS 中浸泡5 min。用10%正常山羊血清封闭1 h，加入兔抗NGB 多克隆抗体（1：200 稀释），4℃过夜。次日，冰箱中取出于室温下放置30 min，PBS 洗片后滴加（1∶500 稀释）Alexa Fluor®594-羊抗兔IgG 荧光二抗，避光孵育1 h。PBS 避光摇洗，终止染色。缓冲甘油封片浓度为50%，倒置荧光显微镜下观察拍照。用PBS 作为阴性对照，其余步骤同上。每张切片在皮质区随机取5个不重叠的视野，计数阳性细胞数，取其均数。

1.6 免疫印迹检测大脑皮质caspase-9 蛋白表达

将各组实验大鼠（每组6 只）大脑皮质经RIPA 裂解液于冰上裂解并及时匀浆。低温离心后取上清液，BCA 法进行蛋白定量。严格按照试剂说明书经过SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、加入一抗兔抗 caspase-9 抗体（1 ∶1 000），4℃孵育过夜。次日洗膜后加入对应的二抗HRP 标记的羊抗兔IgG（1 ∶5 000）室温孵育1 h，曝光显影条带。用图像分析软件IPP 6.0 测定条带的灰度值，测定并计算出caspase-9 与内参β-actin 的比值，进行统计学分析。

1.7 大脑皮质组织生化指标的测定

其余各组大鼠按上述方法进行麻醉，于冰盘上切除小脑和脑干部分后分离右侧半球，取损伤大脑皮质。先用预冷的生理盐水中漂洗脑皮质组织，然后滤纸试干，进行称重。用生理盐水按1：9 的比例将其配成10%的脑组织匀浆液，低温离心机4℃离心10 min（3 500 r/min）后提取上清液。采用考马斯亮蓝法进行脑组织匀浆液的蛋白定量，按照试剂盒说明书分别进行 SOD 活力、MDA含量和GSH-PX 活力的测定。

1.8 统计学处理

计量资料采用±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，P＜0.05 时表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑缺血再灌注后病理形态学的变化

Sham组神经元形态正常，染色均匀，结构清晰，无水肿；胞核蓝染，胞质红染。高倍镜下核大而圆，核仁清晰。I/R组损伤区域正常结构模糊不清紊乱，水肿极为严重；核固缩深染，可见呈筛状的坏死灶。CysC低、CysC中浓度组有不同程度的改善，水肿减轻，有少量细胞核发生核固缩和碎裂。而CysC高浓度组则形态变化明显，有较多神经细胞呈片状分布，染色变浅，胞核固缩，甚至核仁消失、胞质溶解（图1，见封二）。

2.2 Caspase-9 阳性细胞

免疫组织化学检测结果显示caspase-9 主要表达于细胞质，胞核也有表达，呈棕黄色或棕褐色。Sham组有极少量的阳性细胞，I/R caspase-9阳性细胞增多（P＜0.01），CysC低、CysC中浓度组caspase-9 阳性细胞较I/R组明显减少（P＜0.01），而CysC高浓度组阳性细胞数明显增多（表1，图2，见封二）。

2.3 NGB 免疫荧光显色

Sham组大鼠大脑有一定量的NGB阳性细胞，呈红色荧光，主要分布在神经元的胞浆；I/R组损伤侧脑皮质中NGB阳性细胞数增多（P＜0.01）。CysC低浓度组和CysC中浓度组 NGB阳性细胞数较I/R组明显增多（P＜0.01）。CysC高浓度组NGB阳性细胞数较CysC低浓度组和CysC中浓度组显著减少（P＜0.01）；CysC高浓度组与I/R组相比差异无统计学意义（P＞0.05）（表1，图3，见封二）。

表1 各组大脑皮质caspase-9 和NGB 阳性细胞数比较（n=6，±s）

表1 各组大脑皮质caspase-9 和NGB 阳性细胞数比较（n=6，±s）

*P＜0.01 vs 假手术组；△P＜0.01 vs I/R 缺血再灌注组；#P＜0.01 vs CysC低浓度组

组别 Caspase-9 阳性细胞数 NGB 阳性细胞数假手术组 3.33±1.03 65.00±3.74缺血再灌注组 61.50±2.43*# 88.00±5.48*#CysC低浓度组 44.17±2.32*△ 168.00±5.76*△CysC中浓度组 28.33±2.42*△# 199.50±7.15*△#CysC高浓度组 54.67±3.50*# 87.83±5.95*#

2.4 Caspase-9 蛋白表达的变化

免疫印迹检测结果显示：Sham组有较少caspase-9表达；I/R组caspase-9表达升高，CysC低、CysC中浓度组caspase-9 的表达较I/R组有不同程度的减少（P＜0.01）；而CysC高浓度组caspase-9 的表达较CysC低浓度和CysC中浓度组明显升高（P＜0.01）（图 4）。

图4 各组caspase-9 相对表达水平

2.5 损伤侧大脑皮质SOD 和GSH-PX 活力、MDA含量的变化

与Sham组比较，I/R组与CysC低、中浓度组大鼠SOD和GSH-PX活力降低，MDA含量增高（P＜0.01），CysC高浓度组SOD和GSH-PX活力升高，MDA含量降低；与I/R组比较，CysC低、CysC中浓度组SOD和GSH-PX活力增高，MDA含量降低（P＜0.01），CysC高浓度组SOD和GSH-PX活力明显降低，MDA含量显著增高（表2）。

3 讨论

缺血性脑卒中的原因是由于供应脑部血液的动脉发生闭塞性病变，没能得到及时的侧支循环，使脑组织代谢发生供不应求所致。缺血性脑卒中的发病率、致残率和病死率均较高，占脑卒中总数的60%～70%，且大多数患者会遗留有不同程度的瘫痪、失语等残疾[9-10]。

脑缺血再灌注损伤后触发了氨基酸毒性、自由基生成、蛋白酶激活、炎症反应等一系列的级联反应。其最终阶段涉及到caspase介导的细胞凋亡[11-12]，caspase在细胞凋亡的过程中处于中心地位，属于启动性一类，它的激活方式代表了caspase激活的最典型方式，也就是线粒体途径[13]。裴海涛等[14]研究显示，骨形态发生蛋白-7明显抑制了缺血再灌注诱导的皮质区caspase-9蛋白及caspase-9 mRNA 的表达，通过下调caspase-9表达，抑制线粒体凋亡途径来减少神经元凋亡的数目，进而起到对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

表2 各组大鼠大脑皮质SOD、GSH-PX 活力和MDA含量（n=6，±s）

表2 各组大鼠大脑皮质SOD、GSH-PX 活力和MDA含量（n=6，±s）

*P＜0.01 vs 假手术组，△P＜0.01 vs 缺血再灌注组，#P＜0.01 vs CysC低浓度组

组别 SOD（U·mg-1·pro-1）GSH-PX（U·mg-1·pro-1）MDA（nmol·mg-1·pro-1）假手术组 136.73±14.26 113.93±8.33 5.87±1.13缺血再灌注组 71.50±9.53*# 42.81±6.97*# 14.13±0.95*#CysC低浓度组 101.64±7.62*△ 67.22±4.10*△ 11.15±0.59*△CysC中浓度组 120.47±5.30*△# 83.77±6.18*△# 9.15±1.03*△#CysC高浓度组 80.62±9.10 *# 45.31±6.36*# 13.42±1.64*#

国外研究学者于2000年在哺乳动物的大脑首次发现了一种新的球蛋白，这种新的蛋白被称为NGB[2-4]。NGB 主要在神经系统表达，与氧有很高的亲和力，能可逆性的与氧分子结合，并特异性向脑组织供氧，被称为神经元内的呼吸球蛋白[15]。Khan 等[16]研究显示，脑组织中NGB 的表达增加可以降低转基因小鼠的脑梗死体积，提示NGB 在脑缺血缺氧性损伤中对神经元有保护作用。另一方面，NGB 与氧有较高的亲和力具有抗氧化作用。有文献证实NGB 是一种毒性物质的清道夫，它清除缺氧性脑病患者体内的氧化产物，如NO、H2O2、O2-等[17]。Brunori 等[18]报道NGB 具有结合NO 和减轻NO 毒性的作用，推测它具有清除活性氧自由基的作用。当NGB 与CysC 二聚体结合后抑制其胞内转移，可以发挥其抗氧化的作用。

因此，本实验预防性给予药物CysC 处理脑缺血再灌注模型大鼠，研究不同浓度的CysC 对各组大鼠凋亡蛋白caspase-9、NGB 和自由基损伤的影响。免疫印迹结果显示，在CysC低、中浓度组中，随着CysC 药物浓度的升高，caspase-9表达较I/R组明显减少，这和caspase-9 免疫组织化学实验结果吻合。NGB 免疫组化实验结果显示Sham组因仅做颈动脉分离，没有脑组织低氧造成的NGB 应激性增高。在缺血再灌注24 h，皮质损伤半暗带区由于脑缺血缺氧导致NGB 合成增加；CysC低、中浓度组与I/R组相比，NGB 阳性细胞数显著增多。因药物作用促使NGB 增高更加明显，增加的NGB 可能促进氧气向神经元线粒体扩散及传递，以确保线粒体产生能量的需要。同时可显著提高损伤区脑皮质组织SOD 及GSH-PX 活力，降低MDA含量，减轻了氧化应激诱导的脂质过氧化作用。而CysC高浓度组NGB 数量明显减少，同时SOD 及GSH-PX 活力降低，MDA含量增高。神经细胞更容易受到影响，加速了细胞的死亡。曾有学者在大鼠海马区注射较高浓度的CysC，显示高浓度的CysC 聚集在脑组织中可能会诱导神经细胞死亡，具有神经毒性[19-20]。这也与本实验中的结果相符合。本实验高浓度的CysC 未能改善缺血再灌注引起的脑损伤，可能与CysC 浓度过高所致神经毒性有一定的关系。

综上所述，适量浓度的CysC 可通过上调NGB表达，下调caspase-9 的表达，减少自由基浓度，模拟脑缺血预适应的生物效应，从而改善大鼠局灶性脑缺血再灌注造成的神经元损伤；而CysC 使用浓度过高时则对I/R 脑组织造成损害，具有一定的毒性作用。

图版说明（图见封三）

图1 各组缺血再灌注侧神经元形态学变化，H-E染色，标尺=50 μm。A：假手术组；B：缺血再灌注组；C：CysC低浓度组；D：CysC中浓度组；E：CysC高浓度组.

图2 各组大鼠大脑皮质caspase-9 蛋白免疫组织化学显色，标尺=50 μm。A：假手术组；B：缺血再灌注组；C：CysC低浓度组；D：CysC中浓度组；E：CysC高浓度组.

图3 各组大鼠大脑缺血再灌注后NGB 免疫荧光显色，标尺=50 μm。A1～A3：假手术组；B1～B3：缺血再灌注组；C1～C3：CysC低浓度组；D1～D3：CysC中浓度组；E1～E3：CysC高浓度组.