A549肺癌细胞条件培养液促进人骨髓间充质干细胞的增殖和迁移*

姜 杨 王璐璐 金海峰 姚立杰 张 嵩 刘丹阳 李永涛 张善强 沈 雷△

（齐齐哈尔医学院，1 解剖学教研室，2 细胞生物学教研室，3组织学胚胎学教研室，齐齐哈尔 161006）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是促成肺癌发生的因素之一[1]。趋化因子浓度增高能够诱使细胞归巢[2]。趋化因子-8（C-X-C motif chemokine ligand-8，CXCL-8）除了促进MSC运动[3]，还在结肠癌、膀胱癌等肿瘤组织高表达[4-5]，并是预测宫颈癌发生的重要指示[6]，再次证实CXCL-8 对肿瘤细胞迁移具有关键作用。Akt 通路调节的肌动蛋白收缩导致细胞运动[7]，CXCL-8可活化血管内皮细胞Akt-STAT3 通路[8]，促进血管新生[9]。CXCL8 为促进肿瘤生长转移提供了新血管形成、细胞运动等基础条件[10]。虽然非小细胞肺癌高表达的CXCL-8 促进了肺癌发展[11]，但是肺癌细胞通过CXCL8 招募MSC 归巢的作用和机制仍不清楚。本实验在细胞水平观察A549细胞表达的CXCL-8 通过Akt 通路对人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）增殖或运动产生的影响，研究结果将为抑制肺癌提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

hBMSCs 购于武汉普诺赛生命科技有限公司。A549细胞和BEAS-2B 细胞均购于美国菌种保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。人CXCL-8 重组蛋白和triciribine（美国Selleck 公司）；DMEM/F12 培养基、α-MEM 培养基、DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco 公司）；RIPA 细胞裂解液、BCA 蛋白定量检测试剂盒等试剂（上海碧云天生物科技公司）；人CXCL-8、Akt、P-Akt蛋白ELISA 试剂盒（美国Antibodies 公司）；MTT、L-谷氨酰胺、二甲基亚砜（美国Sigma 公司）；Annexin V-PI 细胞凋亡试剂盒（美国Hyclone 公司）。

1.2 细胞培养

A549细胞、BEAS-2B 细胞分别用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养基或DMEM 培养基培养。含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺的α-MEM培养基培养hBMSCs。4.5×106个/mL A549细胞或BEAS-2B细胞在37℃、5%CO2培养12 h，800 r/min 离心5 min，分别提取A549细胞和BEAS-2B细胞上清液，0.22 μm 滤器抽滤，液氮保存。正常条件下，无任何刺激的hBMSCs 为对照组。以体积比1∶4 稀释A549细胞或BEAS-2B 细胞上清液为条件培养基[12]，条件培养基培养的hBMSCs 为A549组 或BEAS-2B组；3组均添加50 nmol/L CXCL-8则为A549 C组和BEAS-2B C组；若同时添加100 nmol/L triciribine则分别为A549 CT组 和BEAS-2B CT组。A549组加入100 nmol/L triciribine 则为A549 T组。

1.3 ELISA 检测CXCL-8、Akt 或P-Akt蛋白含量

人ELISA试剂盒检测A549细胞和BEAS-2B细胞上清液中CXCL-8蛋白含量。4℃，以RIPA细胞裂解缓冲液裂解密度为4.5×106个/mL各组hBMSCs，10 000 r/min离心5 min；BCA蛋白定量检测试剂盒检测总蛋白浓度后，再以人ELISA试剂盒检测各组hBMSCs中Akt或P-Akt蛋白的含量[8]。

1.4 Transwell 细胞迁移实验检测hBMSCs迁移数目

1.5×104个/mL hBMSCs置于Transwell细胞小室内，下层腔室加入按实验分组设置而添加的试剂或条件培养基，37℃，5%CO2培养12 h，擦除transwell细胞小室内hBMSCs，0.01 mmol/L PBS 清洗3次，每次1 min；4%多聚甲醛溶液固定transwell细胞小室60 min，0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次1 min；1%结晶紫染色30 min。Image-Pro Plus 6.0.1（IPP 6.0.1）软件计算单位面积下被结晶紫染色的hBMSCs迁移数目。

1.5 MTT 检测细胞增殖吸光度

0.6×104个/mL hBMSCs加入96孔细胞培养板，37℃，5%CO2培养12 h；按照实验分组分别加入各组条件培养基或试剂。37℃，5%CO2培养12 h；加入5 g/L MTT 溶液，37℃，5%CO2继续培养4 h，再添加二甲基亚砜，Emax Plus 酶标仪在490 nm 波长检测细胞增殖吸光度（absorbance value，A490值）。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

用1.25% Annexin V-FITC溶液重悬2×105个/mL各组hBMSCs，孵育20 min；10 000 r/min离心5 min；0.01 mmol/L PBS清 洗3次，每次1 min；加 入2%PI溶液，冰上孵育2 min，10 000 r/min离心5 min，0.01 mmol/L PBS重悬。FACSAria Ⅱ型流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 统计学处理

实验数据采用SPSS 18.0 软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 hBMSCs 增殖

对照组、BEAS-2B组、A549组、BEAS-2B C组、A549 C组、A549 T组、A549 CT组 和BEAS-2B CT组的A490值分别为0.91±0.05、0.93±0.06、1.13±0.01、1.35±0.07、1.72±0.09、0.94±0.11、1.39±0.06、1.04±0.03，各组hBMSCs增殖的A490值差异具有统计学意义（P＜0.01）。相对于BEAS-2B组和对照组，A549组A490值升高；A549 C组hBMSCs细胞A490值最高；A549 CT组比A549 C组A490值降低。这提示CXCL-8能够促进hBMSCs增殖；A549细胞上清液含有促进hBMSCs增殖的活性成分。

2.2 hBMSCs 凋亡

对照组（43.1%）、BEAS-2B组（40.9%）、A549组（31.2%）、BEAS-2B C组（26.1%）、A549 C组（10.3%）、A549 CT组（13.4%）、BEAS-2B CT组（29.0%）、A549 T组（37.2%），各组细胞凋亡率相比差异具有统计学意义（P＜0.01）（图1）。A549组hBMSCs 凋亡率比BEAS-2B组和对照组显著降低；A549 C组hBMSCs 凋亡率最低，添加了Akt抑制剂的各组hBMSCs 凋亡率比相应各组hBMSCs凋亡率均呈升高趋势。结合细胞增殖实验结果，共同提示A549细胞能够促进hBMSCs 增殖，抑制hBMSCs 凋亡，说明A549细胞分泌的上清液中含有提高hBMSCs 活性的有效因子（图1）。

图1 流式细胞仪检测各组hBMSCs 细胞凋亡

2.3 hBMSCs迁移

Transwell细胞迁移实验结果显示（图2），对照组、BEAS-2B组、A549组、BEAS-2B C组、A549 C组、A549 T组、A549 CT组 和BEAS-2B CT组 穿过transwell 细胞小室基膜的hBMSCs 数目分别为40.53±1.13、42.72±1.55、59.64±1.95、53.67±2.04、75.05±1.37、43.83±2.16、61.32±2.13、35.94±1.81，各组hBMSCs迁移数目差异具有统计学意义（P＜0.01）。相对于BEAS-2B组和对照组，A549组hBMSCs迁移数目升高；A549 C组hBMSCs迁移数目最高；A549 CT组 比A549 C组迁移数目降低。提示CXCL-8 促进hBMSCs迁移的作用可被Akt 抑制剂所抑制。

图2 Transwell 细胞迁移实验检测各组hBMSCs 的12 h 细胞迁移，标尺=100 μm

2.4 A549细胞和BEAS-2B细胞上清液中CXCL-8蛋白的含量

ELISA 验证A549细胞上清液中含有的活性因子显示，A549上清液中CXCL-8含量是（13.108±0.120）ng/L，BEAS-2B上清液CXCL-8含量为（6.053±0.340）ng/L，2组数据相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.5 hBMSCs 的Akt、P-Akt蛋白含量情况

ELISA结果显示各组hBMSCs的Akt和P-Akt蛋白含量分别为：对照组（7.54±1.04）mg/L和（6.93±1.13）mg/L ；BEAS-2B组（7.60±1.69）mg/L和（6.82±1.07）mg/L；A549组（14.27±1.53）mg/L 和（11.92±1.18）mg/L ；BEAS-2B C组（19.03±1.45）mg/L和（16.69±1.02）mg/L；A549 C组（31.52±1.78）mg/L和（29.08±1.93）mg/L；A549 T组（26.31±1.59）mg/L 和（18.42±1.63）mg/L ；A549 CT组（13.23±1.31）mg/L 和（12.90±1.77）mg/L和BEAS-2B CT组（9.24±1.55）mg/L和（6.22±1.43）mg/L。各组hBMSCs的Akt蛋白含量差异具有统计学意义（P＜0.01），P-Akt蛋白含量差异也具有统计学意义（P＜0.01）。相对于BEAS-2B组和对照组，A549组Akt 和P-Akt蛋白含量明显升高；A549 C组Akt和P-Akt蛋白含量明显最高；添加了Akt 抑制剂的各组细胞Akt 和P-Akt蛋白含量比相应各组呈降低趋势。以上结果证明：A549细胞上清液含有的CXCL-8 通过激活hBMSCs 内Akt信号通路，促进hBMSCs 增殖和运动。

3 讨论

3.1 A549细胞表达CXCL-8提高hBMSCs增殖或迁移能力

转移性癌细胞通常不能用传统的外科或放化疗策略根除，治疗后疾病复发极为常见，清除肿瘤干细胞是抑制肿瘤发生发展的关键[13]。干细胞治疗方法在癌症治疗中显示出越来越大的希望。干细胞通过归巢能到达原发性或转移性肿瘤病灶，并以载体的形式稳定表达靶向抗肿瘤药物，可减小肿瘤体积，延长存活时间，减轻治疗副作用[14]。阐明MSC等干细胞归巢到恶性肿瘤微环境的机制，提高MSC归巢率是开展MSC在恶性肿瘤治疗的前提。

MSC 广泛分布在骨髓、脂肪、脐带血等多种组织，容易分离和体外培养。MSC 可多向分化为骨、软骨、脂肪、血管等组织，还能分泌SDF-1α、VEGF、EGF 等大量趋化因子、生长因子等生物活性分子，对维持MSC 干性起着至关重要的调节作用[15]。研究表明，与肿瘤细胞活性相类似，MSC也具有易迁移、向组织归巢运动能力[16]。肺癌细胞与MSC 相互影响，相互促进，MSC 在肺癌等恶性肿瘤的发展和转移中扮演关键作用[17]。目前发现MSC 具有定向迁移到肿瘤组织，促进肿瘤转移的能力，与胃癌、乳腺癌等多种癌症进展有关，表现出较好地维持肿瘤生长的能力[18]。但是从趋化因子角度阐明肺癌组织招募MSC 的机制还不清楚。

本实验采取A549 为研究对象，观察A549 肺癌细胞上清液对hBMSCs 增殖、凋亡和迁移作用效果和机制。相关实验结果提示A549细胞上清液中可能具有活化hBMSCs 的活性物质。袁哲等[19]将A549细胞条件培养基按照体积浓度分为高浓度（100%）和低浓度（50%）2组，使用MTT 和transwell 细胞迁移实验分别观察对人脐带血MSC增殖和迁移的影响，显示低或高浓度A549 条件培养基均明显促进人脐带血MSC 增殖和迁移率，尤以高浓度组实验结果为甚。本实验研究结果与该研究相符。但是袁哲等[19]并未对A549细胞条件培养基对人脐带血MSC 凋亡效果或招募人脐带血MSC归巢的机制进行分析。本研究深入开展了Annexin V-PI 细胞凋亡实验，观察到A549细胞上清液还可以降低hBMSCs 的细胞凋亡率，推测A549 上清液中可能含有某些激活hBMSCs 的活性因子。

张鹏等[20]报道CXCL-8 对人脂肪间充质干细胞具有较好的促进运动能力。趋化因子对多种恶性肿瘤发生发展具有较好调控能力。食管癌表达的CXCL-8（又称IL-8）通过激活STAT3信号通路，抑制NK 细胞定向趋化到癌组织，进而促进食管癌转移和复发[21]。本研究采用ELISA 实验显示A549上清液中CXCL-8表达明显升高，与CXCL-8 在恶性肿瘤组织较高表达的结果相一致[21]。为了进一步验证CXCL-8在A549细胞对hBMSCs的影响，实验又设立了阳性对照组，即向BEAS-2B组或A549组添加了CXCL-8重组蛋白。结果显示，BEAS-2B C组hBMSCs增殖或迁移率明显比BEAS-2B组升高，A549 C组的增殖或迁移率呈现最高，进一步说明CXCL-8在A549细胞条件培养基诱导hBMSCs增殖和迁移能力方面发挥了重要作用。

胰腺癌、胃癌等肿瘤表达CXCL-8 会促进血管新生[22-23]。CXCL-8除了对MSC等细胞具有较强招募作用外[8，20]，还能够促进MSC分泌VEGF，促使血管内皮细胞黏附，加速血管新生等作用[8，22-23]。本实验只检测了CXCL-8一种趋化因子含量，A549细胞分泌的上清液可能还含有其他炎症因子或趋化因子，这些活性成分的检测还需要借助高效液相色谱技术或基因芯片等手段进一步验证。

3.2 A549细胞表达CXCL-8激活hBMSCs内Akt信号通路

添加triciribine 的A549 CT组hBMSCs增殖和细胞迁移率降低，细胞凋亡率升高，更说明A549细胞上清液通过Akt信号通路发挥作用。A549组hBMSCs 的Akt 和P-Akt蛋白表达均明显增加；A549 CT组hBMSCs 的Akt 和P-Akt蛋白表达均明显降低。这说明A549细胞上清液中的CXCL-8与hBMSCs 表面的CXCR1/2 受体结合[24]，能够激活hBMSCs 内Akt信号通路。结合使用Akt 抑制剂的A549 CT组实验结果，再次证明A549 能够表达CXCL-8 趋化因子，通过Akt信号通路发挥了招募MSC 归巢的作用。如果阻断Akt信号通路或其下游的mTOR等相关蛋白，CXCL-8会降低MSC归巢效率，更说明CXCL-8 通过PI3K-Akt-mTOR信号通路使更多的MSC归巢。

综上所述，A549细胞微环境表达的CXCL-8激活hBMSCs 内Akt信号通路，促进hBMSCs 增殖或迁移，对阐明肿瘤微环境与MSC相互作用，揭示肺癌干细胞来源，寻找抑制肺癌发生发展的方法具有非常重要的意义。