亲权鉴定基因座两步突变分析

窦永恒，王润波，张静，王海丽*

（1.河南省生殖健康科学技术研究院，河南郑州 450002；2.河南事缘法医物证司法鉴定所，河南郑州 450002）

短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR）是人类的一类重要的遗传标记，在法医学亲子鉴定、个体识别及遗传病连锁分析等应用中有重要作用[1-2]。在亲子鉴定实践中，出现STR基因座突变的现象是普遍存在的，且其发生突变的主要机制是复制滑动突变，只涉及一个基序的加或减称为一步突变，约占STR基因座的90%，少数突变基因会涉及几个基序，称多步突变[3]。多步突变是通过逐步突变形成的，突变的步数越多，其发生的概率越小，最多突变步数为四步。STR核心序列的变异可能导致对结果分析的偏差甚至误判[4]。因此法医物证工作者和遗传学工作者对于STR基因座突变都很重视。现对1例出现两步基因座突变的亲子鉴定案件进行分析，这在亲子鉴定中出现的概率较小。

1 仪器与方法

1.1 仪器及试剂

AGCU EX22和AGCU EX 21+1荧光检测试剂盒（包括ReactionMix、Primers、Taq酶、Allelic Ladder、AGCU MarkerSIZ-500等），购自无锡中德美联生物技术有限公司；21Plex系统荧光标记检测试剂盒（包括2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA聚合酶、PCR Grade Water、Orange-500等），购自江苏苏博医学科技南京有限公司。Y-STR系统荧光标记检测试剂盒（包括5×PCR反应缓冲液Ⅳ、5×27Y引物混合物、去离子水、ORG-500等），购自基点认知技术（北京）有限公司。GeneAmp 9700热循环仪、3500xl型遗传分析仪等均来自美国应用生物系统公司。直径1 cm大小血斑一份，常温晾干后存储于-20 ℃冰箱。

1.2 PCR扩增和电泳分型

PCR扩增采用血斑直接扩增。PCR扩增体系和扩增程序严格按照试剂盒的说明书操作。每次扩增以阳性对照DNA作阳性对照，阴性对照扩增管中加入纯水。扩增产物应用ABI3500xl型遗传分析仪进行毛细管电泳，由Data Collection v3.0数据收集软件自动收集电泳信息，电泳完成后把生成的数据导入GeneMapper ID-X v1.5软件中分析查看各基因座的基因型。

1.3 统计学分析

根据司法部《亲权鉴定技术规范》（GB/T 37223—2018）和《法医物证鉴定Y-STR检验规范》（SF/Z JD0105007—2018），按照中国汉族人群STR基因座的等位基因频率，根据规范推荐突变率，μ为平均突变率0.002，进行亲权指数（Paternityindex，PI）、累积亲权指数（Cumulative Paternityindex, CPI）的计算。

2 结果与分析

2.1 常染色体STR基因座分型结果

亲子鉴定案件运用21Plex系统检测21个基因座分型结果是否符合遗传规律。在该例亲子鉴定的案件中，发现存在两步突变的可能，涉及的STR基因座为Penta E，其余20个基因座的检测结果全部符合遗传规律（图1）。父亲Penta E基因型为“14,22”，孩子Penta E基因型为“5,20”，孩子位点“20”与父亲位点“22”相差两个重复单位考虑有两步突变的可能。进一步采用AGCU EX22荧光检测试剂盒检测22个基因座复核验证发生突变的STR位点，相同位点的基因座分型一致，除Penta E存在突变的可能，其余均符合遗传规律（图2）。

图2 AGCU EX22亲权鉴定试剂盒的Penta E位点分型图

图1 21Plex亲权鉴定试剂盒的Penta E位点分型图

2.2 新增基因座分型结果

采用AGCU EX21+1试剂盒进一步检测，包含21个STR基因座，其中D19S433基因座21Plex检测系统中也包含，新增加的20个多态性STR基因座全部符合遗传规律。

2.3 Y-STR基因座上的分型结果

本案例共又增加检测了25个Y-STR基因座，被检标本C与被检标本F的Y-STR基因座完全一致，结果如表1所示。

表1 25个Y-STR基因座分型结果

2.4 突变基因座分析

依据人类染色体遗传规律，孩子的遗传基因一定来自亲生父母双方[5]。本案例的孩子突变基因座是由父亲位点突变而来。Penta E基因座PI=0.002，（80×P20）=0.000 467 289 0，40个常染色体STR基因座分型后CPI值为247 186 029.723 9。案例突变基因座位点和PI计算结果见表2。

表2 40个STR基因座分型结果及亲权指数

所谓的突变均是建立于在认定亲权关系的假设上。STR基因座突变与遗传多态性程度有着一定的关系，其主要机制为复制滑动。复制滑动突变主要表现为STR基因座等位基因重复单位的增加或减少[6]。序列结构比较均一的基因座容易发生突变，而等位基因中含有不完全序列的基因座发生突变的概率较低，扩增片段较大的STR基因座更容易发生突变，这可能是由于重复单位多的基因座其长度也较长，必然多态性程度也较高，其突变概率会随之增加[7]。

司法鉴定技术规范要求累计亲权指数大于10 000时，支持被检测男子（或被检测女子）是孩子生物学父亲（或母亲），累计亲权指数小于0.000 1支持被检测男子（或被检测女子）不是孩子生物学父亲（或母亲）。如果只有1～2个基因座不符合遗传规律，累计亲权指数在0.000 1～10 000之间应增加检测其他高度多态性且遗传稳定的STR基因座，以避免由于STR基因座突变导致错误地排除亲权关系[8]。该二联体案例首先用21Plex体系检测20个常染色体STR，出现一个矛盾基因座Penta E，父亲F为（14,22），孩子C为（5,20），相差2个重复单位，累计亲权指数314.0986。用AGCU EX22体系验证其中20个常染色体STR基因座（包括突变基因座），分型结果均一致，累计亲权指数685.439 4。考虑到是父子鉴定，使用Y-STR试剂盒进一步扩增检测，被检样本F与样本C的Y-STR基因型相同，说明二人符合同一父系遗传规律。因为Y-STR基因座具有伴性遗传的特征，不同基因座中存在连锁的可能。本案例虽然检测了25个Y-STR基因座，但是部分基因座之间存在连锁不平衡，鉴于不同的群体中连锁状态不相同，群体遗传学数据有限，检测结果只是作为参考，未计算亲权指数。

STR基因座等位基因的突变与性别也有着一定的相关性。研究发现，来源于父亲的突变多于来源于母亲的突变。基因的突变率与细胞分裂次数密切相关[9]。由于男性精原细胞在发育成为精子前要经过多次分离，且分裂次数远远多于女性卵原细胞分裂的次数，因而DNA复制发生滑动错配的机会就增多，突变概率相应增加。除此之外，年龄等因素的影响也会导致男性DNA突变率高于女性[10]。

3 结论

在亲权鉴定过程中要注意STR基因座突变情况，检测更多的遗传标记不仅能使累计父权指数达到认定亲权关系的标准，也能发现更多的突变现象。通过多种PCR试剂盒的相互证实突变结果的客观存在，并增加其他遗传多态性好、突变率低的基因座位点进行综合判断，排除各种可能因素的干扰，可以有效避免错判的风险，从而得到科学、客观、可靠的鉴定意见。