益母草生物碱的提取工艺研究及含量测定

胡慧慧，纪昂，张明慧，冯亚莉

（郑州工业应用技术学院药学与化学工程学院，河南新郑 451100）

益母草为唇形科植物益母草Leonurus japonicas Houtt.的新鲜或干燥地上部分[1]，又称茺蔚、坤草、月母草、旋风草、益母蒿等，归心、肝、膀胱经，其味苦、辛，性微寒。《本草纲目》记载：“此草及子皆茺盛密蔚，故名茺蔚，其功宜于妇人及明目之精，故有益母之称”。益母草有活血调经、利尿消肿、清热解毒之功能，素有“血家圣药”“经产良药”之称[2]。现代药理研究表明，益母草对神经系统、心血管系统、肾脏等有保护作用，还具有抗癌、抗炎、抗糖尿病、抗骨质疏松、抑制胰脂肪酶活性等药理作用[3-5]。益母草的化学成分比较复杂，主要有生物碱类、黄酮类、二萜类、挥发油类、多肽类等[6]，其中生物碱类成分是益母草的主要药效物质，包括盐酸益母草碱和水苏碱等[7]。本文采用水提、回流、超声等不同提取方法对益母草中总生物碱和盐酸益母草碱的提取率进行了研究，采用雷氏盐剩余比色法测定总生物碱的含量，采用HPLC法测定盐酸益母草碱的含量，以确定益母草的最佳提取工艺，从而为益母草药品的炮制、制剂开发及质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

干燥益母草购于亳州市张仲景中药饮片有限责任公司，经郑州工业应用技术学院谢新年教授鉴定为唇形科植物益母草的干燥地上部分，粉碎后备用。

1.2 仪器与试剂

UV-2550型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；HPLC-1260高效液相色谱仪，中国安捷伦科技有限公司；SQP电子天平，赛多利斯科学仪器公司；超声波清洗机，济南巴克超声波科技有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；LG10-2.4A离心机，深圳永业昌机电有限公司；FW177中药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。

对照品盐酸水苏碱，批号YS210722、盐酸益母草碱，批号YS181221，纯度≥98%，购自中国食品药品检定研究院；雷氏盐，批号180901，天津市光复精细化工研究所；乙腈，批号180324，色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇，批号180409，色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；其他所用试剂和溶剂均为分析纯。

1.3 提取方法

1.3.1 水提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，适量蒸馏水浸泡过夜，水煎煮3次，溶剂用量分别为10倍、6倍、5倍，提取时间分别为2.0 h、1.5 h、1.0 h，趁热抽滤，合并滤液，冷却，浓缩至10.00 mL，自然挥发成浸膏或干浸膏，备用。

1.3.2 酸水提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，以1%盐酸水溶液浸泡过夜，煎煮提取3次，溶剂用量分别为10倍、6倍、5倍，提取时间分别为2.0 h、1.5 h、1.0 h，趁热抽滤，合并滤液，冷却，浓缩至10.00 mL，自然挥发成浸膏或干浸膏，备用。

1.3.3 乙醇提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，以95%乙醇浸泡过夜，加热回流提取3次，溶剂用量分别为10倍、6倍、5倍，提取时间分别为2.0 h、1.5 h、1.0 h，趁热抽滤，合并滤液，冷却，浓缩至10.00 mL，自然挥发成浸膏或干浸膏，备用。

1.3.4 酸性乙醇提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，以0.1%盐酸的95%乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取3次，溶剂用量分别为10倍、6倍、5倍，提取时间分别为2.0 h、1.5 h、1.0 h，趁热抽滤，合并滤液，冷却，浓缩至10.00 mL，自然挥发成浸膏或干浸膏，备用。

1.3.5 乙醇超声提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，以10倍量的95%乙醇浸泡过夜，置超声清洗机中处理40 min，抽滤，浓缩至10.00 mL，自然挥发成浸膏或干浸膏，备用。

1.3.6 索氏乙醇提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，在索氏提取器中，以10倍量的95%乙醇溶液提取至虹吸管无色为止，抽滤，浓缩至10.00 mL，自然挥发成浸膏或干浸膏，备用。

1.3.7 索氏酸性乙醇提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，在索氏提取器中，以10倍量的0.1%盐酸的95%乙醇溶液提取至虹吸管无色为止，抽滤，浓缩至10.00 mL，自然挥发成浸膏或干浸膏，备用。

1.4 含量测定方法

1.4.1 总生物碱含量测定

采用雷氏盐剩余比色法测定样品中总生物碱的含量。生物碱的硫氰酸铬铵盐沉淀溶于丙酮中，溶解成的紫红色液体在510 nm波长下有最大吸收。

样品溶液的制备：取适量不同提取方法得到的益母草提取物，以0.1 mol/L的盐酸超声溶解，过滤，所得滤液用相同盐酸溶液定容至100 mL容量瓶中。

分别取上述样品溶液5.00 mL于小烧杯中，缓慢滴加新鲜配制的2%雷氏盐溶液5.00 mL，置冰箱中过夜，过滤后得紫红色沉淀，用冷水洗涤沉淀至无色，抽滤。沉淀用丙酮溶解，定容至100 mL容量瓶中。以丙酮为空白，在最大吸收波长510 nm处测定吸光度（A），代入式（1）可计算总生物碱量，根据式（2）求出总生物碱的得率。

式（1）中，M为盐酸水苏碱的相对分子质量，值为179.63；ε是硫氰酸铬铵在丙酮中的分子吸收系数，值为106.5；V为待检测的溶液体积，100 mL。

1.4.2 盐酸益母草碱含量测定

（1）色谱条件：采用高效液相色谱法测定样品中盐酸益母草碱的含量。参照《中国药典》[1]中盐酸益母草碱高效液相色谱法含量测定条件，选用以下色谱条件对7种提取方法得到的盐酸益母草碱进行定量分析。色谱柱：SBC-18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）；检测波长：277 nm；流速：1.00 mL/min；柱温：30 ℃。

（2）对照品溶液的制备[1]：精密称定盐酸益母草碱对照品0.2000 mg，用70%乙醇定容在1 mL容量瓶中，即得浓度为0.2000 mg/mL的对照品溶液。

（3）样品溶液的制备[8]：取7种不同提取方法得到的浸膏，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次20.00 mL，收集正丁醇后段液层，蒸干，再用70%乙醇定容到10 mL容量瓶，离心，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，待进样。

（4）标准曲线绘制：精密吸取适量盐酸益母草碱对照品溶液，加70%乙醇配制成含盐酸益母草碱浓度分别为0.006 mg/mL、0.015 mg/mL、0.030 mg/mL、0.060 mg/mL、0.120 mg/mL等标准系列溶液。上述色谱条件下将10 μL标准系列溶液精密吸取注入高效液相色谱仪中进行测定。以盐酸益母草碱峰面积（Y）为纵坐标，稀释后溶液浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。

（5）样品测定：分别精密量取10 μL样品溶液，进样，测定峰面积，代入标准曲线方程计算样品溶液中盐酸益母草碱的含量。

2 结果与分析

2.1 总生物碱含量测定结果

不同提取方法所得提取物中总生物碱含量测定结果见表1。由表1可得，采用不同提取方法得到的益母草总生物碱的得率不同，提取得到的益母草总生物碱量与提取方法和溶剂都有一定的相关性。采用回流提取法，用0.1%盐酸的95%乙醇溶液进行提取时，益母草总生物碱的提取率最高，同时该方法得到的浸膏量少，即杂质量较少。因此，可以采用0.1%盐酸的95%乙醇溶液回流提取法对益母草药材进行提取。

表1 不同提取方法所得益母草提取物的浸膏得率和总生物碱量比较

2.2 盐酸益母草碱的含量测定

2.2.1 线性关系考察

标准曲线回归方程为Y=17 741X-7.395，r=0.999 4。结果表明盐酸益母草碱在0.06～0.12 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.2 样品中盐酸益母草碱的含量测定

由表2可以看出，7种不同的提取方法中，酸性乙醇回流提取法提取得到的盐酸益母草碱的含量最多，含量为0.282 mg/g，得率为0.028 2%。

表2 不同提取方法的样品中盐酸益母草碱含量分析

3 结论

以0.1%盐酸的95%乙醇溶液为溶剂，采用回流提取法得到的益母草总生物碱和盐酸益母草碱含量均为最高，分别为2.14 mg/g和0.282 mg/g，且样品中杂质少，利于富集。这可能是由于益母草生物碱结构上胍基基团的存在，使之易于与酸成盐，因此在酸性乙醇溶液中溶解性较大，提取率也高。本文的工作为益母草中药制剂的开发以及其药理作用的进一步研究提供了依据。