抗幽门螺杆菌细胞空泡毒素纳米抗体的制备及鉴定

刘晓芳，刘琼，黄云祥，钟引凤，何庆华，李燕萍，涂追，付金衡*

（1.南昌大学 生命科学学院，江西南昌 330031；2.中德联合研究院，江西南昌 330047；3.食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047；4.南昌大学基础医学院，江西南昌 330031）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种慢性感染的病原菌，世界卫生组织将其定为Ⅰ类致癌原[1]，细胞空泡毒素（Vacuolating cytotoxin，Vac A）是Hp产生并经自转运蛋白途径分泌到胞外的蛋白，在体外能使宿主细胞产生空泡变性，VacA还可引起线粒体膜通透性改变，抑制细胞凋亡[2]、诱导肿瘤细胞自噬[3]、促进HCO3-释放并降低胃酸分泌[4]等。针对特异性识别VacA的研究主要体现在肽[5]、单链抗体（scFv）[6]、卵黄抗体[7]和单克隆抗体[8]，然而具有亲和力高、稳定性好、免疫原性低、分子量小、易于基因工程改造的纳米抗体[9-10]却未见报道。

因此，本实验聚焦抗Hp细胞空泡毒素纳米抗体的研究，构建了纳米抗体噬菌体免疫文库，采用固相亲和淘选技术，从该文库中获得了抗幽门螺杆菌VacA纳米抗体，通过基因工程技术获得了原核表达的纳米抗体，并进行了初步功能鉴定，为抗幽门螺杆菌VacA纳米抗体的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

幽门螺杆菌J99菌株质粒由南昌大学基础医学院刘琼讲师提供；大肠杆菌TG1、噬菌粒载体pComb3XSS、辅助噬菌体M13KO7、原核表达载体（pET25b）为实验室保存；卵清蛋白（OVA）、牛血清蛋白（BSA），购自上海生工生物工程有限公司；TA克隆试剂盒购自Takara；EasyGeno快速重组克隆试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 获取幽门螺杆菌VacA基因及原核表达

据NCBI上AF049653.1的VacA基因设计引物，VacA-F1为 5'-GGAATTCCGAAATACAACAA ACACACCGC-3'（EcoRI），VacA-R1 为 5'-CCG CTCGAGCGGATTGGTACCTGTAGAAACATTAC-3'（xhoI）。以Hp菌液为模板进行PCR扩增VacA基因。根据Mighty TA-cloning Kit进行TA克隆以减小序列突变的概率，电转至E.coliDH5α感受态中，菌落PCR验证阳性克隆并测序。EcoRI和HindⅢ双酶切pMD20-T-VacA质粒和pET25b质粒，酶连电转至E.coliRosetta感受态中，1 mmol/L IPTG 25 ℃诱导4 h，超声破碎SDS-PAGE鉴定。

1.2.2 重组蛋白的变性、纯化及复性

目的蛋白用包涵体洗涤液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%Triton-100）洗涤，加入包涵体变性液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT，8 mol/L尿素），于4 ℃下变性1 h，离心取上清过Ni柱纯化，在含高纯度目的蛋白的洗脱液中加入等体积的复性液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L GSH，0.3 mmol/L GSSG，0.5 mol/L L-精氨酸）3次以逐步稀释尿素浓度，用10 kDa透析管透析后备用。

1.2.3 抗幽门螺杆菌纳米抗体噬菌体展示文库的构建

用灭活的HpJ99菌株四次免疫羊驼后取血提总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，通过巢式PCR方法获得VHH基因，第一步以AlpVh-LD（5'-CTTGGTGGTCCTGGCTGC-3'） 和 CH2-R（5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'） 为 引物，扩增出约700 bp的VH域；第二步以VHH-1（5'-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3'） 和 VHH-2（5'-CATGCC ATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCG CTGTGGTGCG-3'）或 VHH-3（5'-CATGCCATGACT CGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCT TGGG-3'）为引物，扩增出约500 bp的VHH基因。VHH基因和噬菌粒载体pComb3XSS用S fiⅠ单酶切，T4DNA连接酶连接后电转至E.coliTGI感受态细胞中，固态培养12 h，M13KO7辅助噬菌体感染，构建抗Hp纳米抗体的噬菌体展示文库，并通过插入率、库容及多样性评估文库质量。

1.2.4 抗Hp纳米抗体噬菌体展示文库的淘选及阳性噬菌体鉴定

以重组蛋白VacA为靶点，从纳米抗体噬菌体展示免疫库中筛选出能特异性结合VacA的纳米抗体。按表1条件进行三轮筛选，每一轮筛选后，取10 μL洗脱物测滴度，剩余洗脱物扩增后用于下一轮的筛选。间接phage-ELISA鉴定阳性菌，具体操作方法参照文献[11]。OD450样本值/OD450阴性对照值≥2视为阳性菌，将阳性菌进行特异性验证并测序。

表1 固相淘选条件

1.2.5 抗重组幽门螺杆菌VacA纳米抗体的原核表达

根据EasyGeno快速重组克隆试剂盒设计能特异性扩增VHH基因的引物F'（5'-AGCCGGCGATGGCCATGCAGTTGCAGCTCGTGGATGC-3'） 和R'（5'-ATCTCGAGTGCGGCCGCCTGGCCGGCCTGGCC GTCTTG-3'），pET25b（+）用 Nco Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切后，按EasyGeno快速重组克隆试剂盒配制10 μL的连接体系，于50 ℃反应15 min立即冷却钙转至Rosetta（DE3）感受态细胞中固态过夜培养，随机挑取单克隆进行菌落PCR验证并测序。用0.1 mmol/L IPTG振荡培养6 h超声破碎，将含有目的蛋白的上清进行Ni柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化结果。

1.2.6 鉴定抗重组幽门螺杆菌VacA纳米抗体结合Hp的活性

通过间接酶联免疫吸附剂测定（ELISA），鉴定原核表达的抗VacA纳米抗体结合Hp的活性[11]，包被3 μg/mL的幽门螺杆菌全菌蛋白，结合时，加入不同浓度的纳米抗体，测OD450，根据OD450样本值/OD450空白对照值≥2时，即认为纳米抗体在该浓度下具有结合幽门螺杆菌的能力。

1.2.7 抗重组幽门螺杆菌VacA纳米抗体抑制Hp鉴定

通过在一定时间内测定CO2浓度的变化，评估纳米抗体抑制幽门螺杆菌活性的能力，即体外培养幽门螺杆菌至1×109CFU与不同浓度的纳米抗体于4 ℃下孵育16 h，加入100 μL 500 mmol/L尿素和0.2 g/L的酚红混合液于37 ℃下孵育3 h，每30 min测定OD550，根据公式（1）计算抑制率。

2 结果与分析

2.1 幽门螺杆菌VacA基因的扩增、蛋白表达及纯化

琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物如图1A所示，大约2 200 bp左右有一条与幽门螺杆菌VacA基因理论分子量大小（2 248 bp）相近的条带，故成功扩增到幽门螺杆菌VacA基因片段。阳性克隆子原核表达后SDS-PAGE电泳如图1B所示，VacA重组蛋白分子量大小约85 kDa，与理论值相符，复性后获得高纯度的目的蛋白。

图1 幽门螺杆菌VacA PCR产物及蛋白鉴定图

2.2 抗幽门螺杆菌纳米抗体噬菌体展示文库的构建

如图2A所示，在泳道1中可见18S和28S两条带，表明RNA没有降解。两步巢式PCR技术扩增VHH基因片段，第一步巢式PCR产物鉴定如图2B所示，750 bp左右出现长铰链重链抗体编码的可变区基因目的条带；第二步反应以第一步回收纯化后的产物作为模板进行扩增，如图2C所示，在450 bp左右出现与预期扩增的VHH片段大小相符的条带，纯化PCR产物将其与噬菌粒载体pComb3XSS分别进行S fiⅠ酶切，酶连后电转至E.coliTGI感受态中，37 ℃固态培养12 h，随机挑取24个单菌落进行菌落PCR验证。如图3A所示，在650 bp左右有条带，计算出VHH基因插入率为87.5%，测序后进行多序列比对结果如图3B所示，21个阳性克隆的基因均为编码VHH的基因序列，抗体库的有效库容达到4.68×107CFU。

图3 噬菌体展示文库菌落PCR鉴定及序列比对图

图2 VHH总RNA及巢式PCR产物鉴定图

2.3 抗幽门螺杆菌纳米抗体噬菌体展示文库的淘选

以重组蛋白VacA为靶分子，经过3轮固相淘选，每轮以“吸附-洗涤-洗脱-扩增”为主要步骤，逐轮降低靶分子包被浓度、文库投入量，通过增加洗涤次数来富集特异性结合VacA的纳米抗体，结果如表2所示，噬菌体克隆得到有效富集。

表2 各轮淘选中结合VacA的噬菌体克隆的滴度和富集度

2.4 间接phage-ELISA鉴定阳性克隆

包被重组蛋白VacA，间接phage-ELISA鉴定阳性菌，将OD450样本值/OD450阴性对照值≥2的噬菌体送测序，采用Alignment进行多序列对比分析，得到6种抗体序列，选取吸光度值较高的阳性噬菌体进行交叉验证，结果如图4所示。克隆HV2-36 OD450值较高且与BSA和OVA无交叉反应，因此，采用HV2-36进行后续实验。

图4 间接phage-ELISA鉴定阳性菌

2.5 表达载体pET25b（+）-HV2-36的构建及纳米抗体的表达与纯化

阳性克隆的菌落PCR鉴定结果如图5A所示，在750 bp处扩增到目的条带及测序结果表明，表达载体pET25b（+）-HV2-36构建成功。将重组表达载体钙转至E.coliRosetta(DE3)感受态细胞，0.1 mmol/L IPTG诱导表达6 h，SDS-PAGE鉴定纯化效果，结果如图5B所示，在20 kDa处有符合目的蛋白分子量大小的条带。

图5 纳米抗体重组载体克隆子的菌落PCR鉴定及原核表达图

2.6 HV2-36结合幽门螺杆菌的活性分析

以破碎的幽门螺杆菌全菌蛋白为检测抗原，分别测定不同浓度的纳米抗体HV2-36结合幽门螺杆菌的活性。如图6所示，纳米抗体浓度为112.4 μg/mL时对Hp几乎无结合力。

图6 间接ELISA鉴定纳米抗体结合幽门螺杆菌活性图

2.7 纳米抗体HV2-36抑制幽门螺杆菌活性分析

不同浓度的纳米抗体与109CFU幽门螺杆菌J99菌株孵育，通过检测一定时间内CO2浓度的变化，分析纳米抗体抑制Hp活性的能力。如图7所示，当纳米抗体浓度在30 μg/mL时，HV2-36抑制率为31.13%。

幽门螺杆菌是一种引起多种疾病的革兰氏阴性微需氧菌，其致病性主要与尿素酶B[12]、细胞毒素相关蛋白A、细胞空泡毒素[13]、黏附素[14]等致病因子有关。本实验以重组蛋白VacA为靶标，从Hp灭活菌免疫后构建的噬菌体展示文库中筛选出与重组蛋白VacA特异性结合的阳性噬菌体，测序发现，从多样性较好的文库中，淘选获得了6种不同序列的阳性噬菌体。具有独特性质的纳米抗体，不仅能够结合细菌表面抗原，拮抗细菌对宿主细胞的黏附[15]，还可通过拮抗细菌侵袭有关的毒力因子产生抗菌作用[16]。抗尿素酶B纳米抗体能有效抑制尿素酶的活性，从而减少Hp在胃黏膜上皮细胞的定植，所以纳米抗体被认为是一种颇具前景的Hp感染的治疗方法[17-18]。

3 结论

本实验挑选出与重组蛋白VacA结合力较高的HV2-36进行原核表达载体的构建，获得了可溶性好且表达量高的HV2-36纳米抗体，采用间接ELISA鉴定其能特异性结合Hp。HV2-36纳米抗体浓度为30 μg/mL时，对Hp抑制率达到了31.13%，该研究结果为使用纳米抗体检测和治疗幽门螺杆菌感染奠定了基础。