生物基聚丁内酰胺肠衣膜的性能分析

张添添，陈启明，赵黎明，姜舒文，陈 涛

（华东理工大学生物工程学院，发酵工业分离提取技术研发中心，生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

香肠是我国肉制品的主要品类之一，占据整体肉制品市场近1/3。2014—2016年我国香肠行业的产量分别约为620、635、618万 t，市场规模分别约为573.8、608.3、583.6亿 元[1]。可见，香肠具有稳定增长的市场需求。

肠衣作为一种重要的肉类包装，在国内外都具有非常强的消费刚性。其基本功能是保证香肠在一定条件及时间内不变质，以满足贮存及流通的需要。肠衣主要有天然肠衣和人造肠衣，天然肠衣是采用健康牲畜肠道制备灌制香肠的衣膜[2]，可食用、口感好。但动物肠道的个体差异导致天然肠衣残次品率高，不利于机械化生产且资源有限[3-4]。人造肠衣主要包括胶原蛋白肠衣和塑料肠衣。胶原蛋白肠衣是以猪、牛皮真皮层的胶原蛋白纤维为原料，加入辅料后经化学和机械处理制成[5]，厚度均匀、氨基酸含量丰富、具有可食性，适用于机器灌肠生产。但胶原蛋白肠衣的蛋白质分子质量分布较窄且分子质量低，导致其机械性能不好，在严苛的加工条件下可能会发生崩解，应用范围有限[6-8]。大部分人造肠衣属于塑料肠衣，多为复合膜或共混挤出膜，由于加入了很多低熔点的烯烃类材料和助剂，其机械强度高，利于生产和加工，但是塑料肠衣不可降解，能够给环境造成负担。因此，研究一种具备优良力学性能和阻隔性能且可降解的肠衣，对于香肠产业未来的发展有重要的意义。

聚丁内酰胺（polybutyrolactam，PA4）又称聚酰胺4，分子式为[NH(CH2)3CO]n。PA4是一种生物基材料，可通过生物发酵的γ-氨基丁酸经高压聚合得到[9-11]。PA4已被证明可被海水和土壤中的微生物降解，具有优异的生物降解性[12-16]，是目前发现的唯一可生物降解的聚酰胺。此外，PA4具有高强度、耐磨性和生物相容性等特点，在食品包装方面具有极大的应用潜力。然而，PA4的分子链间氢键密度大，极易结晶，导致其韧性较差，因此需要通过与其他材料共混以改善其力学性能。壳聚糖（chitosan，CS）由甲壳素经脱乙酰得到，是迄今发现的唯一天然碱性多糖，具有抗菌、抗氧化、生物相容性、生物可降解等性质[17-19]，可作为抗菌剂、保鲜剂、澄清剂等应用于食品和保健品[20]。CS可与聚酰胺类聚合物共同混合形成一定的相互作用，从而改善聚酰胺的力学性能[21-27]。因此，本实验室前期采用流延法以可降解生物基PA4为主体，与CS共混制备出一种可降解型生物基PA4肠衣膜，但是目前PA4肠衣膜在肠衣包装中的基本性能尚不明确。

本实验以PA4肠衣膜为对象，比较其与市售尼龙复合肠衣和市售胶原蛋白肠衣在力学性能、阻隔性能、热收缩率、耐撕裂性能、总迁移量、抗菌性能及对猪肉香肠的保鲜性等方面的差异，探究了PA4肠衣膜在肠衣包装应用上的价值，评价了PA4肠衣膜的优劣势，为其在肉类包装领域中的应用提供参考，并拓展环保肠衣材料的开发。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

大肠杆菌CICC23657为实验室分离菌株；PA4肠衣膜由实验室自制。

体积分数95%乙醇（分析纯） 上海泰坦科技股份有限公司；高岭土（分析纯）、无水乙醇（分析纯）阿拉丁试剂（上海）有限公司；胰蛋白大豆肉汤液体培养基、卵磷脂吐温大豆酪蛋白（soya casein digest lecithin Tween polysorbate，SCDLP）培养液、平板计数琼脂培养基 杭州百思生物科技有限公司；尼龙复合肠衣（以PA6和聚烯烃为主体，多层复合结构膜） 天津市润泽塑料包装制品有限公司；胶原蛋白肠衣（以牛皮二层蛋白为主体） 广西神冠控股（集团）有限公司；猪肉香肠原料为市售。

1.2 仪器与设备

HSX-150恒温恒湿箱 上海海向仪器设备厂；TM210万能试验机 广东东莞欧美奥兰检测设备有限公司；W3/031水蒸气透过率测试仪、VAC-V2压差法气体渗透仪 济南兰光机电技术有限公司；Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 PA4肠衣膜的制备

PA4肠衣膜采用流延法制备，将PA4和CS按照一定比例溶解后进行共混，置于恒温恒速磁力搅拌器中均匀分散12 h，静置1 h脱泡，得到PA4肠衣膜液后，流延浇注在玻璃模具上，于30 ℃、相对湿度55%的恒温恒湿箱中烘干后，揭膜，得到PA4肠衣膜。其中，CS所占的质量比例不超过50%。同时，将PA4溶解后，采用流延法制备纯PA4膜，留作备用。

1.3.2 力学性能测定

PA 4 肠衣膜与市售肠衣拉伸强度和断裂伸长率的测定参照GB/T 1040.1—2018《塑料 拉伸性能的测定 第1部分：总则》[28]。将PA4肠衣膜和市售肠衣裁成150 mm×14 mm的条状，样品两端固定于十字夹具，设定标线距离为100 mm，拉伸速率50 mm/min。同时以PA4膜为对照，测定其力学性能。每种样品设置5 个平行，取平均值。按照式（1）和式（2）分别计算拉伸强度和断裂伸长率。

式中：σ为拉伸强度/MPa；F为最大负荷/N；b为样品宽度/mm；d为样品厚度/mm。

式中：ε为断裂伸长率/%；L为样品断裂时标线的距离/mm；L0为原始标线距离/mm。

1.3.3 阻氧性能测定

PA4肠衣膜与市售肠衣的氧气透过系数测定参照GB/T 1038—2000《塑料薄膜和薄片气体透过性试验方法压差法》[29]。将PA4肠衣膜和市售肠衣裁成直径为9 cm的圆片，置于实验台中间，用真空脂密封边缘，盖上测试腔。输入样品的厚度，温度23 ℃，抽真空6 h，进行氧气透过性能测试。按照式（3）计算氧气透过系数。

式中：pg为氧气透过系数/（cm3·cm/（cm2·s·Pa））；Δp/Δt表示在氧气稳定透过时，单位时间内低压室气体压力变化的算术平均值/（Pa/s）；V为低压室体积/cm3；S为样品的面积/cm2；p1-p2为样品两侧的压力差/Pa；T0、p0分别表示标准状态下的温度（273.15 K）和压力（1.013 3×105Pa）；D为样品的厚度/cm；T为实验温度（296.15 K）。

1.3.4 阻水性能测定

PA4肠衣膜与市售肠衣的水蒸气透过系数测定参照GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法 杯式法》[30]。将PA4肠衣膜和市售肠衣裁成直径7.3 cm的圆片，贴在加入10 mL去离子水的透湿杯上，置于测试仓内密封。输入样品的厚度，相对湿度为90%，温度38 ℃，循环称质量6 次，每次间隔5 min，进行水蒸气透过性能测试。按照式（4）计算水蒸气透过系数。

式中：pv为水蒸气透过系数/（g·cm/（cm2·s·Pa））；t为质量增量稳定后的前后间隔时间/h；Δm为t时间内的质量增量/g；S为样品的透水蒸气有效面积/cm2；D为样品的厚度/cm；Δp为样品两侧的水蒸气压差/Pa。

1.3.5 热收缩率测定

PA 4 肠衣膜与市售肠衣的热收缩率测定参照GB/T 12027—2004《塑料 薄膜和薄片加热尺寸变化率试验方法》[31]在160 ℃下进行，按照张启纲等[32]的方法计算横向热收缩率和纵向热收缩率。

1.3.6 总迁移量测定

总迁移量是食品接触材料的安全质量指标之一，不同肠衣材料向香肠中迁移的非挥发性物质总量即为总迁移量。参照GB/T 31604.8—2016《食品安全国家标准 食品接触材料及制品 总迁移量的测定》[33]和GB/T 4806.1—2016《食品安全国家标准 食品接触材料及制品 通用安全要求》[34]进行测定。以体积分数10%乙醇和95%乙醇作为食品模拟物浸泡液，40 ℃全浸没10 d。将只加入浸泡液设置为空白对照。同时测定纯PA4膜在10%乙醇浸泡液的总迁移量。按照式（5）计算总迁移量（overall migration limit，OML）。样品和空白对照组都设置3 个平行，取平均值。

式中：OML为总迁移量/（mg/dm2）；m1为样品测定消耗的浸泡液残渣质量/mg；m2为空白浸泡液残渣质量/mg；V为样品浸泡液总体积/mL；V1为测定消耗的浸泡液体积/mL；S为样品与浸泡液接触面积/dm2。

对PA4肠衣膜在体积分数10%乙醇中进行迁移实验后的总迁移物（记作PA4C-OML）进行红外光谱表征，并与PA4肠衣膜（记作PA4C）和CS膜的红外谱图进行比对。

1.3.7 耐撕裂性能测定

PA4肠衣膜与市售尼龙复合肠衣的耐撕裂力和撕裂强度参照GB/T 16578.1—2008《塑料薄膜和薄片 耐撕裂性能的测定 裤形撕裂法》[35]进行测定。

1.3.8 抗菌性能评价

PA 4 肠衣膜与市售肠衣的抗菌性能测定参照GB/T 31402—2015《塑料 塑料表面抗菌性能试验方法》[36]。将肠衣膜和市售肠衣裁成2.5 cm×2.5 cm的正方形，把无抗菌性能的聚乙烯（polyethylene，PE）膜裁成2.0 cm×2.0 cm的正方形作为覆盖膜，紫外照射杀菌12 h。取10 µL大肠杆菌菌液到胰蛋白大豆肉汤液体培养基，37 ℃、150 r/min，培养至OD值达到0.6左右。将样品膜放入无菌的培养皿中，测试面朝上，吸取100 µL接种液，滴加到膜表面，用PE膜盖于接种菌液上。同时接种到PE膜表面，作为空白组。接种后37 ℃培养24 h，将膜转移至SCDLP培养液中，充分冲洗和振荡，回收菌液。对回收的菌液进行10 倍梯度稀释，各取稀释液100 µL接种到平板计数琼脂培养基上进行涂布。37 ℃培养48 h后计数。根据式（6）计算活菌数，根据式（7）计算抗菌性能（R值表示抗菌性能，R＞1表示具有一定的抗菌性，且R越大，抗菌性越好；R＜1表示无抗菌性）。

式中：N为活菌数/（CFU/cm2）；C为两个培养皿的平均菌落数/（CFU/mL）；D为稀释倍数；V为用于洗脱的SCDLP培养液体积/mL；S为覆盖膜的表面积/cm2。

式中：R为抗菌性能（l g（C F U/c m2））；Ut为未经抗菌处理样品接种后24 h菌落数的对数平均值（lg（CFU/cm2））；At为经抗菌处理样品接种后24 h菌落数的对数平均值（lg（CFU/cm2））。

1.3.9 对猪肉香肠保鲜性的影响

猪肉香肠的制备方法：称取500 g猪肉（53%（以原料总质量计，下同））、谷氨酰胺转氨酶（0.65%）、盐（2%）、糖（2%）、大豆蛋白（3%）、玉米淀粉（10%）、红曲红（0.05%）、复合磷酸盐（0.7%）、冰水（2 7.5%）、酪蛋白钠（1%）、亚硝酸钠（0.1%），用搅拌机进行混合，将混合均匀的猪肉香肠原料填充到PA4肠衣膜和市售肠衣中，90 ℃水浴加热30 min杀菌，然后迅速冷却，4 ℃下贮存。

菌落总数测定：在贮存0、7、14、21、28 d时，参照GB/T 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[37]对不同肠衣材料制备的香肠分别测定菌落总数。

1.4 数据处理与分析

采用Origin 8.0软件和GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理与分析，采用t检验进行显著性差异分析，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 力学性能测定结果

图1 不同肠衣材料的拉伸强度（A）和断裂伸长率（B）Fig.1 Tensile strength (A) and elongation at break (B) of different casing materials

肠衣的力学性能是香肠加工、运输和贮存的重要保障，是防止过度内部-外部相互作用的有效屏障，能够影响包装的耐久性[38]。图1为不同肠衣材料的拉伸强度（图1A）和断裂伸长率（图1B）。PA4肠衣膜的拉伸强度为84.42 MPa，断裂伸长率为73.34%，已达到GB/T 17030—2008要求（拉伸强度≥60 MPa，断裂伸长率≥50%）[39]，相比于纯PA4膜力学性能明显提高。原因是PA4肠衣膜中添加了CS，CS的氨基与PA4的酰胺键之间能产生一定的氢键相互作用，从而增强PA4的拉伸强度和断裂伸长率。此外，与市售肠衣相比，PA4肠衣膜的力学性能优于市售胶原蛋白肠衣，略低于市售尼龙复合肠衣。市售胶原蛋白肠衣中的蛋白质分子质量一般不高，因此其延展性差，所以断裂伸长率较低。市售尼龙复合肠衣是由PA6和聚烯烃类以及多种塑料助剂形成的多层复合结构，具有较好的力学性能。

2.2 阻氧性能测定结果

肠衣作为肉类包装材料，高阻氧性可避免肉类受到微生物污染、脂质氧化、腐败变质等食品安全问题[40]。图2是不同肠衣材料的氧气透过系数。PA4肠衣膜、市售尼龙复合肠衣、市售胶原蛋白肠衣的氧气透过系数分别为2.448×10-16、1.283×10-15、2.385×10-15cm3·cm/（cm2·s·Pa）。PA4肠衣膜的阻氧性最优。市售尼龙复合肠衣主体成分为PA6，相比于PA4，其含有的连接强极性基团的酰胺键密度较低，因此阻隔氧气等非极性气体的能力更低。晶体是影响阻隔作用的重要因素，结晶度高、晶体含量高、阻氧性强，虽然市售胶原蛋白肠衣的酰胺键含量高于市售尼龙复合肠衣，但是市售胶原蛋白肠衣的原料来源于牛皮提取的胶原蛋白，含有的氨基酸种类多，分子链短、规整性差、结晶度低，所以阻氧性低于含有长链高分子的市售尼龙复合肠衣。

图2 不同肠衣材料的氧气透过系数Fig.2 Oxygen permeability coefficients of different casing materials

2.3 阻水性能测定结果

图3 不同肠衣材料的水蒸气透过系数Fig.3 Water vapor transmission coefficients of different casing materials

肉类包装环境中的水分含量高，会促进微生物生长，微生物滋生易造成食品腐败，从而影响产品的品质和货架期。图3为不同肠衣材料的水蒸气透过系数。PA4肠衣膜、市售尼龙复合肠衣、市售胶原蛋白肠衣的水蒸气透过系数分别为2.046×10-13、2.042×10-14、1.082×10-12g·cm/（cm2·s·Pa）。PA4肠衣膜阻水性优于胶原蛋白肠衣，次于市售尼龙复合肠衣。这是由于胶原蛋白肠衣中的蛋白质分子质量低，分子链间缠结作用差，水分子易透过，同时酰胺键密度大，造成其吸水性强；市售尼龙复合肠衣中PA6酰胺键密度最低并含有非极性的聚烯烃成分，且为多层复合膜结构，因此具有较好的阻水性能。

2.4 热收缩率测定结果

肠衣的热收缩率过大会造成肠体包裹不紧实，浪费包装；热收缩率过小，易导致肠体变形或撑破肠衣。因此，适宜的热收缩率能够提高商品的外观性，降低包装成本。表1为不同肠衣材料的热收缩率。PA4肠衣膜、市售尼龙复合肠衣、市售胶原蛋白肠衣的横向热收缩率分别为-2.5%、-13%、-0.5%，纵向热收缩率分别为-2.5%、-18%、-1%。玻璃化转变温度是高分子聚合物从玻璃态转变为高弹态所对应的温度，即聚合物分子链段可以运动的最低温度。高分子聚合物的玻璃化转变温度越低，分子链运动的阻力越小，受热后越易发生变形，因此，在同一受热条件下，玻璃化转变温度低的材料更易于分子链热运动，发生链的蜷缩，从而产生热收缩。市售尼龙复合肠衣中PA6和聚烯烃的玻璃化转变温度低于PA4[41-42]，因此市售尼龙复合肠衣具备更高的热收缩率。

表1 不同肠衣材料的热收缩率Table 1 Heat shrinkage rates of different casing materials

2.5 耐撕裂性能测定结果

图4 不同肠衣材料的耐撕裂力（A）和耐撕裂强度（B）Fig.4 Tear force (A) and tear resistance (B) of different casing materials

耐撕裂性能是影响肠衣使用方便性的重要因素，耐撕裂力过小，不利于香肠包装或贮存；耐撕裂力过大，在香肠食用时不方便。实验过程中，市售胶原蛋白肠衣在撕裂时不能沿着样品的中心线撕裂到底端，根据GB/T 16578.1—2008要求[35]，耐撕裂性能较差，无法计算。图4为不同肠衣材料的耐撕裂力和耐撕裂强度。PA4肠衣膜、市售尼龙复合肠衣的耐撕裂强度分别为33.47、40.85 MPa，耐撕裂力分别为1.98、2.25 N。PA4肠衣膜和市售尼龙复合肠衣的耐撕裂性能相仿，且达到GB/T 17030—2008中所规定耐撕裂力≥0.20 N的要求[39]，且PA4肠衣膜的耐撕裂性能小于市售尼龙复合肠衣，更方便香肠食用。

2.6 抗菌性能测定结果

表2为不同肠衣材料的抗菌性能。PE膜、PA4肠衣膜、市售尼龙复合肠衣、市售胶原蛋白肠衣的活菌数分别为1.35×104、10、1.00×104、1.85×104CFU/cm2，PA4肠衣膜、市售尼龙复合肠衣、市售胶原蛋白肠衣的抗菌性能分别为3.13、0.13、-0.13（lg（CFU/cm2））。表明市售尼龙复合肠衣和市售胶原蛋白肠衣抗菌性能均较差，PA4肠衣膜具有良好的抗菌性能。PA4肠衣膜含有的CS是一种天然碱性多糖，其结构内含有的游离氨基能够被质子化，与细菌细胞膜的负电离子相结合，从而破坏细菌的细胞壁，起到抑制微生物生长的作用[43]。

表2 不同肠衣材料的抗菌性能Table 2 Antibacterial activity of different casing materials

2.7 总迁移量的测定结果

GB/T 4806.7—2016《食品安全国家标准 食品接触用塑料材料及制品》规定[44]，食品接触用塑料材料及制品的总迁移量限量为10 mg/dm2。表3是两种不同条件下不同材料的总迁移量。在体积分数95%乙醇模拟液中，市售尼龙复合肠衣和PA4肠衣膜中的总迁移量均在限量以下，而市售胶原蛋白肠衣的总迁移量超过限量；在体积分数10%乙醇模拟液中，市售尼龙复合肠衣和纯PA4膜中的总迁移量在限量以下，市售胶原蛋白肠衣和PA4肠衣膜的总迁移量超过限量。

对PA4肠衣膜的总迁移物进行红外光谱分析鉴定。图5是PA4C、CS膜和PA4C-OML的红外光谱图。PA4中因含有—CO—NH，酰胺I带位于1 630 cm-1处，酰胺II带位于1 540 cm-1处。O—H和N—H的伸缩振动重叠形成多重吸收峰，CS在3 440 cm-1处产生宽谱带，另外，CS由于C3—OH的C—O伸缩振动在1 120 cm-1和1 025 cm-1处出现特征峰。PA4C-OML在3 440 cm-1附近均有宽的特征峰，在1 120 cm-1和1 025 cm-1处也出现特征峰，在1 630 cm-1和1 540 cm-1处出现微弱的特征峰，且纯PA4膜在体积分数10%乙醇中的总迁移量仅有2.39 mg/dm2，证明PA4肠衣膜在体积分数10%乙醇中总迁移物超量的主体是CS。CS是食品原料，无毒性，可食用，不会造成食品安全问题[45]。

表3 两种不同条件下不同材料的总迁移量Table 3 Overall migration limits of different casing materials when contacting with food simulants

图5 PA4C、CS膜和PA4C-OML的红外光谱Fig.5 Fourier transform infrared spectra of PA4C, CS film and PA4C-OML

2.8 猪肉香肠不同贮存期的菌落总数测定结果

香肠变质主要是由微生物生长繁殖引起的，香肠中菌落总数低于5（lg（CFU/g））时才可以安全食用[46]。图6是不同肠衣材料制备的猪肉香肠菌落总数变化。香肠在0～28 d贮存过程中，市售尼龙复合肠衣和PA4肠衣膜包装的猪肉香肠菌落总数均低于限量，并且肠衣表面无变黏和发霉现象，满足食品安全要求。由市售胶原蛋白肠衣包装的猪肉香肠在第21天时菌落总数为5.28（lg（CFU/g）），且肠衣材料表面变黏，第28天时菌落总数为6.09（lg（CFU/g）），肠衣材料表面发霉。PA4肠衣膜保鲜性能明显优于胶原蛋白肠衣，但稍差于市售尼龙复合肠衣，可能的原因是市售尼龙复合肠衣阻水性优于PA4肠衣膜。

3 结 论

本实验探究了实验室自制的以可降解生物基PA4和CS为原料制备的生物基PA4肠衣膜性能。PA4肠衣膜具有良好的力学性能、热收缩率和耐撕裂性能，满足塑料肠衣的标准要求，阻氧性能、抗菌性能优于市售尼龙复合肠衣和市售胶原蛋白肠衣，阻水性能优于市售胶原蛋白肠衣。PA4肠衣膜在体积分数95%乙醇模拟液中，总迁移量符合限量要求，且低于市售尼龙复合肠衣和市售胶原蛋白肠衣，更加安全可靠；在体积分数10%乙醇模拟液中，迁移物的主体为CS，无安全问题。此外，PA4肠衣膜具有良好的抗菌活性，可更好地应用于食品保鲜，从而减少包装和肉类产品中防腐剂的使用，绿色安全，在4 ℃可贮存猪肉香肠28 d，保鲜性优于市售胶原蛋白肠衣，在低温肉制品中具有很好的应用潜力。

后期可通过制备多层复合膜，进一步改善PA4肠衣膜的力学性能和阻水性能，从而进一步延长食品货架期，扩大其在肉类食品包装方面的应用范围。