桑叶生物碱对肝纤维化小鼠的改善作用及机制

王祖文，沈以红，黄先智，丁晓雯,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆 400716；2.西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 北碚 400716）

肝纤维化是多种慢性肝病转化为肝硬化的中间过程，其主要特征是肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活、肝细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积[1-2]。肝纤维化发生过程受多条信号传导通路控制，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是主要的促纤维化细胞因子，TGF-β1/Smads通路是激活HSC促进ECM生成的主要途径[3-4]。而ECM的合成与降解平衡受基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）的控制，MMP蛋白促进ECM降解，TIMP蛋白通过抑制MMP的活性进而抑制ECM降解[5]。TGF-β1的过表达可抑制MMPs表达，促进TIMPs表达，进而导致ECM沉积，加剧肝纤维的形成[6]。因此调控TGF-β1/Smads信号通路以及TIMPs/MMPs的表达对逆转肝纤维化的发生发展有重要作用[7-8]。

桑叶生物碱是桑叶的特征活性成分之一，可降糖降脂[9-10]、抗机体大分子氧化损伤[11-12]、改善高脂饮食诱导的肝损伤[13]等。本实验室前期研究发现50、100、200 mg/kgmb剂量的桑叶生物碱均能在不同程度上降低肝纤维化模型小鼠血浆谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、肝纤维标志物透明质酸（hyaluronicacid，HA）、层黏连蛋白（laminin，LN）、IV型胶原蛋白（collagen IV，Col IV）、III型前胶原（type III precollagen，PC-III）等指标水平，降低机体炎症反应、减轻氧化应激反应，对肝纤维化具有改善作用[14]。因此，本研究拟通过建立CCl4联合高脂饮食诱导的小鼠肝纤维化模型，观察桑叶生物碱对TGF-β1/Smads通路相关信号分子及MMP-13、TIMP-1mRNA相对表达量的影响，进一步探讨桑叶生物碱对肝纤维化的改善作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性昆明种小鼠60 只（4 周龄），体质量（20±2）g，由重庆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（渝）2018-0003。基础饲料，购于重庆医科大学实验动物中心；高脂饲料，实验室自制。配方：基础饲料69.5%（质量分数，下同）、猪油12%、蔗糖10%、蛋黄粉4%、胆固醇4%、胆酸钠0.5%[13]。

桑叶粉末，重庆畜牧科学院蚕业研究所提供。桑叶生物碱，实验室自制[12]。本实验所制得的桑叶生物碱的总生物碱质量分数为93.57%。

橄榄油、四氯化碳（CCl4）、氯仿 成都市科龙化工试剂厂；水飞蓟宾（纯度98%） 南京道斯夫生物科技有限公司；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、I型胶原蛋白（collagen I，Col I）、III型胶原蛋白（collagen III，Col III） 上海优选生物科技有限公司；高纯总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）北京百泰克生物技术有限公司；cDNA第一链反转录试剂盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）宝生物工程（大连）有限公司；2×实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）扩增的预混合溶液（HieffTMqPCR SYBR®Green Master Mix (No Rox)） 上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Synergy H1型酶标仪 美国基因有限公司；T100T型PCR仪 美国Bio-Rad公司；qTOWER3G型qPCR仪德国耶拿公司；NanoDrop ND-2000C型微量紫外分光光度计 美国Thermo公司；ALPAAI-4LSC型高速离心机 德国Christ公司；DHP-9082型恒温培养箱上海齐欣科学仪器有限公司；5880 R型冷冻离心机德国Eppendorf公司；DW-HL438型超低温冰箱 合肥美菱股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及处理

本研究获得西南大学实验动物保护协会许可，小鼠按照西南大学实验动物保护和使用规则饲养，室温22～25 ℃，相对湿度40%～60%，12 h明暗交替（9:00至21:00），自由进食饮水。60 只昆明种小鼠适应性喂养7 d后，随机分成正常对照组、模型组、阳性药物组及桑叶生物碱低、中、高剂量组，各10 只。造模组腹腔注射体积分数10% CCl4橄榄油溶液（5 mL/kgmb），隔天注射1 次，持续8 周，并在此期间给予高脂饲料喂养；正常对照组小鼠腹腔注射等量橄榄油溶液，并给予基础饲料喂养。造模成功判定方法：每组随机选取2 只小鼠，颌下静脉取血，测定各组小鼠血浆中ALT、AST活力及肝纤维化4 项指标（HA、LN、PC III、Col IV）水平，若参与造模的小鼠与正常对照组小鼠的同一指标值之间差异具有统计学意义，肝纤维化小鼠肝脏组织病变明显，胶原沉积，则判定为造模成功。

待造模成功后，低、中、高剂量组分别灌胃50、100、200 mg/kgmb桑叶生物碱溶液，阳性药物组灌胃100 mg/kgmb水飞蓟宾溶液，正常对照组和模型组给予等量蒸馏水（10 mL/kgmb），每日1 次，连续灌胃45 d，同时喂饲基础饲料。

1.3.2 实验样本的获取与肝组织α-SMA、Col I、Col III水平的测定

灌胃结束后，将实验小鼠禁食12 h，断颈处死，解剖取出肝脏，称取适量肝组织，加入9 倍体积的生理盐水，在冰浴中机械匀浆。4 ℃，3 000 r/min离心10 min后取上清液备用。

肝组织α-SMA、Col I、Col III水平测定按照酶联免疫试剂盒说明书标示的步骤进行。

1.3.3 荧光实时定量PCR测定肝组织mRNA相对表达量

按照TRIzol试剂盒提取纯化操作方法提取肝脏组织总RNA，所得的RNA进行完整性及纯度测定。按反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA第一链，再进行PCR扩增。qPCR体系10 μL：SYBR Green I 4.2 μL、上游引物0.3 μL、下游引物0.3 μL、H2O 4.2 μL、cDNA 1 μL。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，如表1所示。反应条件：95 ℃、4 min预变性；95 ℃、15 s变性，55～60 ℃、30 s退火，共40 个循环。以β-actin作内参基因，分别测定肝组织TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7、TIMP-1、MMP-13mRNA相对表达量，结果以2-△△Ct表示。

表1 引物序列及产物Table 1 Primer sequences used in this study and length of corresponding amplification products

1.4 数据统计分析

实验结果均以平均值±标准差表示，采用SPSS 20.0软件对结果进行单因素方差分析，多组平均数的比较采用Duncan’s法检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。采用Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 桑叶生物碱对小鼠血浆ALT、AST活力及肝纤维化4 项指标水平的影响

实验前期研究证明，CCl4联合高脂饮食诱导8 周后，模型组小鼠血浆AST、ALT活力以及肝纤维化4 项指标（HA、LN、PC III、Col IV）水平与正常对照组小鼠相比显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）[14]。在造模成功的基础上，分别灌胃50、100、200 mg/kgmb剂量的桑叶生物碱45 d，对应的低、中、高剂量组小鼠血浆AST、ALT活力和肝纤维化4 项指标水平均得到不同程度改善，与模型组结果具有统计学差异（P＜0.05），病理学切片结果也同样观察到小鼠肝纤维化状况得到改善。

2.2 桑叶生物碱对小鼠肝组织α-SMA、Col I及Col III质量浓度的影响

表2 桑叶生物碱对小鼠肝组织α-SMA、Col I及Col III质量浓度的影响（n＝10）Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloid on the contents of α-SMA, Col I and Col III in liver tissue of mice (n= 10)

由表2 可知，与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织α-SMA、Col I及Col III质量浓度均显著升高（P＜0.05），提示HSC被激活，肝组织中ECM沉积，与前期实验结果中肝组织病理切片结果一致（此处略）[14]，表明在CCl4联合高脂饮食作用下小鼠表现出肝纤维化。与模型组比，阳性药物组与桑叶生物碱各剂量组小鼠肝组织α-SMA、Col I及Col III质量浓度均呈现下降趋势；阳性药物组小鼠肝组织α-SMA、Col I及Col III质量浓度分别下降了15.69%、23.14%、15.03%（P＜0.05），其中Col I质量浓度与正常对照组差异不具有统计学意义（P＞0.05），α-SMA、Col III质量浓度与正常对照组差异具有统计学意义（P＜0.05）；灌胃高剂量桑叶生物碱45 d后，小鼠肝组织α-SMA、Col I及Col III质量浓度分别下降了19.55%、19.93%、13.84%（P＜0.05），上述3 个指标与阳性药物组之间差异不具有统计学意义（P＞0.05），但均未恢复到正常水平。结果表明，桑叶生物碱可在一定程度上降低HSC的活化程度，减少ECM沉积，但在实验剂量、时间范围内未能恢复到正常水平。

2.3 桑叶生物碱对肝纤维小鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响

肝纤维化的发生发展中有许多信号通路参与，其中TGF-β1/Smads通路有着很重要的作用。因此探讨了桑叶生物碱对该通路相关信号分子的基因表达的影响。

2.3.1 桑叶生物碱对小鼠肝组织TGF-β1、Smad3mRNA表达的影响

图1 桑叶生物碱对小鼠肝组织TGF-β1和Smad3 mRNA表达的影响Fig.1 Effect of mulberry leaf alkaloid on the mRNA expression of TGF-β1 and Smad3 in liver tissue of mice

由图1可知，正常对照组小鼠肝组织TGF-β1和Smad3mRNA相对表达量分别为0.306 0±0.041 2、0.208 7±0.038 3；与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织TGF-β1、Smad3mRNA表达水平分别升高了230.29%、382.80%（P＜0.05）。与模型组比，阳性药物组和桑叶生物碱各剂量组TGF-β1mRNA表达水平分别降低了58.40%、44.27%、53.28%、59.04%（P＜0.05）；Smad3mRNA表达水平分别降低了64.69%、17.16%、54.43%、56.73%（P＜0.05），但均未恢复到正常水平。其中，中、高剂量组TGF-β1mRNA表达水平与阳性药物组间差异不具统计学意义（P＞0.05），但对Smad3的调节效果不如阳性药物。以上结果表明，桑叶生物碱可下调TGF-β1/Smads信号通路中TGF-β1和Smad3mRNA的表达，进而抑制HSC的活化，减少胶原蛋白的生成，但作用效果有限。

2.3.2 桑叶生物碱对小鼠肝组织Smad4和Smad7mRNA表达的影响

图2 桑叶生物碱对小鼠肝组织Smad4和Smad7 mRNA表达的影响Fig.2 Effect of mulberry leaf alkaloid on the mRNA expression of Smad4 and Smad7 in liver tissue of mice

由图2 可知，正常对照组小鼠肝组织S m a d 4和Smad7mRNA相对表达量分别为0.359 7±0.034 6、2.540 7±0.366 3；与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织S m a d 4m R N A 表达水平升高了1 7 9.5 6%（P＜0.05），Smad7mRNA表达水平降低了60.35%（P＜0.05）。与模型组比，阳性药物组和桑叶生物碱各剂量组Smad4mRNA表达水平分别降低了53.60%、34.59%、54.62%、50.70%（P＜0.05），Smad7mRNA表达水平分别升高了9 1.7 6%、3 7.0 8%、4 8.2 9%（P＜0.05），但均未恢复至正常水平。其中，中、高剂量的桑叶生物碱对Smad4mRNA表达调节效果与本实验剂量的阳性药物差异不具有统计学意义（P＞0.05），但对Smad7的调节效果不如阳性药物。以上结果表明，桑叶生物碱能下调TGF-β1/Smads信号通路中Smad4基因表达，上调Smad7的表达，减少或抑制Smad4与磷酸化Smad3复合物的形成，从而有助于减少胶原蛋白的生成和HSC的活化，但作用效果有限。

2.4 桑叶生物碱对肝纤维小鼠TIMP-1和MMP-13 mRNA表达的影响

正常情况下，ECM的合成与降解处于动态平衡；当肝脏出现损伤，HSC被激活时，TIMPs表达将上调，MMPs表达下调，二者动态平衡被打破时，ECM沉积，导致肝纤维化的不断发展[14]。因此探讨了桑叶生物碱是否会影响MMP-13和TIMP-1这两种酶的表达。由图3可知，正常对照组小鼠肝组织TIMP-1、MMP-13m R N A 相对表达量分别为0.2 0 2 0±0.0 4 9 6、1.580 8±0.143 8。与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织TIMP-1mRNA表达水平升高了396.84%（P＜0.05），MMP-13mRNA表达水平降低了36.50%（P＜0.05）。除低剂量组MMP-13表达量与模型组差异无统计学意义外，其余各组TIMP-1、MMP-13mRNA相对表达量均显著降低或升高（P＜0.05）。与模型组比，阳性药物组与桑叶生物碱中、高剂量组TIMP-1mRNA表达水平分别降低了64.91%、41.38%、49.09%（P＜0.05），MMP-13mRNA表达水平分别升高了25.21%、16.00%、25.72%（P＜0.05），但均未恢复至正常水平。中、高剂量桑叶生物碱对MMP-13mRNA表达的调节作用与实验剂量阳性药物差异无统计学意义（P＞0.05），而对TIMP-1的调节效果不如阳性药物。以上结果表明，桑叶生物碱在一定程度上可调节控制ECM合成与降解的酶TIMP-1、MMP-13mRNA表达水平，从而改善小鼠肝纤维化。

图3 桑叶生物碱对小鼠肝组织TIMP-1和MMP-13 mRNA表达的影响Fig.3 Effect of mulberry leaf alkaloid on the mRNA expression of TIMP-1 and MMP-13 in liver tissue of mice

3 讨 论

正常动物体内，HSC维持静止的非纤维化表型，此时ECM由一系列大分子组成，包括胶原蛋白（I、III、IV、V、VI型）以及LN和纤维连结蛋白在内的非胶原糖蛋白和蛋白多糖[16]。当肝脏受到某些因素持续刺激时，机体内大量生成的炎症因子和氧化应激等反应会激活HSC转化为具有增殖、迁移、收缩和分泌ECM能力的肌成纤维细胞样细胞，导致肝纤维化的形成[17-18]。α-SMA是HSC活化的标志物[19]，Col I、III质量浓度的增加表明肝脏出现ECM沉积[20]。本实验肝纤维化模型小鼠肝组织α-SMA、Col I和Col III质量浓度显著上升，说明CCl4联合高脂饮食造成小鼠肝HSC细胞被激活，出现ECM沉积，小鼠具有肝纤维化症状。在灌胃桑叶生物碱45 d后，肝纤维化小鼠的肝组织中α-SMA、Col I和Col III质量浓度显著降低，说明该实验剂量下的桑叶生物碱可降低肝纤维小鼠HSC的活化程度、减少肝组织ECM的沉积，有助于肝纤维化的改善。

肝纤维化的形成发展离不开肝脏中各种细胞生长因子、血管活性因子及脂肪因子的参与，其中TGF-β1是促纤维化中最重要的细胞因子之一，可通过Smad依赖性和非依赖性信号传导途径发挥其生物学和病理学活性，TGF-β1/Smads信号通路作为干预治疗肝纤维化的有效靶点一直备受关注[21-22]，在TGF-β1/Smads信号通路中，Smads蛋白是TGF-β1信号转导途径的中心环节，其中受体调节型Smad（R-Smad）如Samd2、Samd3蛋白是TGF-β1介导的组织纤维化的两个主要下游调节因子。与Smad2不同，Smad3可与多种促纤维化细胞因子的DNA序列直接结合，促进纤维化的发生，因此它可能是纤维化信号传导过程中的关键因子[6]。而Smad4（通用型Smad）是信号传递必须的中心转导分子，与磷酸化的R-Smad结合形成复合物参与信号传递；而Smad7（抑制型Smad）是TGF-β1/Smads通路的负反馈调节因子，抑制R-Smad与受体的结合或者磷酸化[23]。当肝脏遭受外界刺激或发生损伤时，机体会释放细胞因子TGF-β1，TGF-β1通过与膜上受体结合，促进Smad3蛋白磷酸化，磷酸化Smad3蛋白与Smad4蛋白结合，形成的复合物由细胞质进入细胞核，与靶基因启动子的特定DNA序列结合，从而调控ECM的合成、降解和HSC的转化；而Smad7蛋白通过干扰Smad3蛋白的磷酸化反应，阻碍TGF-β1通路信号的传导，从而抑制纤维化的发展[6,24]。

一些天然活性成分如白屈菜红碱[25]、槲寄生生物碱[26]、垂盆草总黄酮[27]、黄芪多糖[28]、杜仲多糖[29]均可通过调节TGF-β1/Smads信号通路中相关基因的表达来抑制HSCs的活化增殖，起到改善肝纤维化的作用。因此本实验在前期研究基础上，进一步探究桑叶生物碱对肝纤维化小鼠肝组织TGF-β1/Smads信号通路的影响。实验结果显示，在CCl4与高脂饮食联合因素刺激下小鼠肝组织TGF-β1、Smad3、Smad4mRNA表达上升，而Smad7mRNA表达下降，与众多研究结果[25,28,30]一致。在灌胃桑叶生物碱45 d后，桑叶生物碱能显著下调肝纤维化小鼠肝组织中TGF-β1、Smad3、Smad4mRNA的表达，上调Smad7mRNA表达，且中、高剂量的桑叶生物碱对TGF-β1、Smad4mRNA的调节结果与100 mg/kgmb水飞蓟宾水溶液效果相当，对Smad3和Smad7的调节作用逊于水飞蓟宾。虽然肝纤维化小鼠在实验周期内未恢复正常，但该结果说明桑叶生物碱能通过调控TGF-β1/Smads信号通路相关基因的表达，抑制HSC的活化，减少ECM的合成。

ECM的合成与降解主要通过MMPs和其特异性抑制剂TIMPs之间的动态平衡来维持。MMPs和TIMPs是受TGF信号传导途径调节的靶基因，在机体受到刺激时，细胞因子TGF-β1可促进TIMPs表达，抑制MMPs的活性，减少ECM的降解，加深肝纤维化[31]。MMPs有6 类，其中间质胶原酶类MMP-13具有降解ECM中主要成分Col I和Col III的能力[32]；TIMPs有4 类，在肝脏中仅存TIMP-1、TIMP-2，而TIMP-1对绝大对数的MMPs都有抑制作用[33]。本研究结果显示：与正常对照组比，模型组小鼠肝组织TIMP-1mRNA表达上升，MMP-13mRNA表达下降，与安祯祥[34]、姜辉[35]等的研究结果一致。在灌胃桑叶生物碱45 d后，桑叶生物碱能显著下调肝纤维化小鼠机体中TIMP-1mRNA的表达，上调MMP-13mRNA的表达，且中、高剂量对MMP-13mRNA表达的调节作用与100 mg/kg水飞蓟宾溶液相当，对TIMP-1的调节作用逊于水飞蓟宾。该结果说明桑叶生物碱可能通过调节MMP-13、TIMP-1基因表达，促进Col I和Col III的降解，减轻小鼠肝纤维化。

综上，桑叶生物碱通过调节TGF-β1/Smads信号通路转导来抑制HSC的活化，从而减少ECM的生成，还可以通过下调TIMP-1、上调MMP-13基因表达来促进ECM的降解，达到改善肝纤维化的效果。该实验为桑叶生物碱在改善肝脏疾病方面提供了一些依据，但于此同时，桑叶生物碱是否直接作用TGF-β1/Smads通路中相关信号分子，以及本实验没有显著的量效关系，这是否与靶点或受体饱和有关，需做进一步研究。此外肝纤维化发生发展是多细胞、多因子共同参与的结果，桑叶生物碱改善肝纤维化的其他途径也有待进一步探讨。