3种红豆杉茎段腋芽启动组培繁育技术研究

焦 骄 刘 婧 付玉杰 王 馨 盖庆岩 鹿 瑶 徐晓杰 王紫莹

（东北林业大学化学化工与资源利用学院，森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040）

红豆杉（Taxusspp.）又称紫杉是紫杉科（Taxaeae）红豆杉属（Taxus）的常绿乔木慢生树种，作为古老的第四纪冰川遗种，在地球上拥有悠久的演化历史［1］。众所周知，红豆杉中特有的紫杉醇活性成分对卵巢癌、前列腺癌、食管癌、人肝癌、头颈部肿瘤及恶性淋巴瘤等具有显著的治疗效果［2］。据报道，一棵百年树龄的红豆杉仅能获取300 mg 左右的紫杉醇，但是治疗一个癌症病人通常需要2.5～3 g 的紫杉醇，以此推算则需消耗8 棵左右百年树龄的红豆杉［3～4］。据此，紫杉醇的强劲市场需求已对红豆杉资源产生了巨大的破坏。此外，天然红豆杉结实率低，种子萌发周期长且出芽率低，同时红豆杉自然生长极其缓慢，再加上人类的过度开发利用已造成其野生资源濒临枯竭，全球范围内多个国家已将其列为珍稀濒危保护物种［5～6］。

近些年来，植物组培快繁技术已成为对濒危物种进行高效繁育、保护和可持续利用的有效手段，也是当前植物学研究的热点和重点领域［7］。植物组培快繁技术是依托于细胞全能特性，通过无菌操作和适宜的培养条件，在短时间内诱导植物原生质体、细胞、组织及器官等启动、增殖和生根，最终获得遗传性质稳定均一的完整植株的技术，具有培养周期短、繁殖系数高、不受季节限制、方便选育新品种等优点，尤其在繁育保护稀缺植物种质资源方面具有显著优势［8～9］，如水杉、天目铁木、崖柏、海伦兜兰等极小种群濒危植物［10～13］。就红豆杉而言，已有多项研究报道尝试利用其茎和叶等外植体脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化形成不定芽，遗憾的是这种方法在愈伤组织诱导、继代和再分化过程中极易出现褐化死亡现象，最终未能形成一种有效组培繁育技术体系［14～16］。除此之外，还有研究者尝试利用南方红豆杉成熟胚为外植体进行组培扩繁研究，但是结果发现该方法培养周期过长，操作过程繁琐且效率低下［17～18］。因此，亟需开发一种可靠的离体组培繁育技术体系，以期实现对红豆杉这一濒危种质资源进行有效保护，进而可保证红豆杉产业良性健康发展。

本文以我国特有的3 种红豆杉（东北红豆杉、南方红豆杉和曼地亚红豆杉）为研究对象，采用茎段腋芽启动组培技术对这3 种红豆杉进行繁育研究。选取上述3 种红豆杉带有腋芽的茎段组织为外植体，系统考察了腋芽启动、增殖和生根培养过程中所需植物激素组合，以期建立一种或几种简单有效的红豆杉繁育技术体系，为我国红豆杉种质资源的保护和可持续利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室实验园中生长状态良好的3种红豆杉（东北红豆杉、南方红豆杉和曼地亚红豆杉）为实验对象。选取每种红豆杉生长旺盛部位的嫩枝前段带腋芽的茎段组织（6～8 cm）为供试材料。

1.2 材料的消毒处理

经过多次预试验，我们确定了最优的外植体消毒方法，具体操作过程如下：将带腋芽的3 种红豆杉茎段供试材料用自来水持续冲洗4 h，在超净工作台中用75%乙醇溶液消毒30 s，无菌水冲洗3次，再用4%次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水冲洗3 次，用无菌滤纸吸干茎段表面水分，剥去茎段外面的幼叶，再将茎段组织切割为带有2～3 个腋芽的外植体（2 cm左右），待接种。

1.3 培养基的配制

以MS 和WPM 培养基为基本培养基，配制添加有不同种类和不同浓度植物生长激素（6-BA、NAA 和IBA）的实验培养基。具体如下：在MS 培养基的基础上，分别添加细胞分裂素6-BA（0.1～1.0 mg·L-1）和生长素NAA（0.1～1.0 mg·L-1），按照实验设计［如图1（A）和图2（A）所示植物激素组合］配制成11 种启动和增殖培养基；在WPM 培养基的基础上，分别添加生长素NAA（0.1～1.0 mg·L-1）和IBA（0.1～1.0 mg·L-1），按照实验设计［如图3（A）所示植物激素组合］配制成11 种生根培养基。上述每种培养基中均加入蔗糖30 g·L-1，琼脂8 g·L-1，并调节培养基初始pH 值为5.80±0.05，然后在0.1 MPa压强和121℃下高温灭菌20 min。

1.4 茎段腋芽启动培养

将带有2～3 个腋芽的3 种红豆杉茎段外植体接种到上述含有植物激素（6-BA 和NAA）的11 种MS 启动培养基上，置于温度25±2℃、光照强度2 000 lx、光周期16 h·d-1的条件下进行培养。每个启动培养基内接种3～4 个带腋芽的茎段外植体，每种红豆杉样品做6 个重复。经过30 d 的启动培养，观察并统计不同红豆杉种类茎段外植体上腋芽点的萌动和生长情况。

1.5 增殖继代培养

待启动后的腋芽长到2～3 cm，在超净工作台中将其切割下来，转接到上述含有植物激素（6-BA和NAA）的11 种MS 培养基上进行增殖培养。每个增殖培养基内接种2～3 个不定芽，每种红豆杉样品做6 个重复，培养温度、光照强度和光周期等其他培养条件如1.4 中所述，在60 d 左右的生长期内观察腋芽的增殖生长状况，观察并统计不同种类红豆杉新生不定芽点的萌发数量。

1.6 生根培养

选取增殖培养后长势较好的不定芽（高度5～6 cm），将其转接到上述含有植物激素（NAA 和IBA）的11 种WPM 培养基上进行生根培养。每个生根培养基内接种1～3 个不定芽，每种红豆杉样品做20～30 个重复，培养温度、光照强度和光周期等其他培养条件如1.4 中所述，在90 d 左右的生长期内观察不定芽根部生长状况，观察并统计不同种类红豆杉不定芽的生根数量。

1.7 数据统计

本实验中涉及的数据和图表均用Microsoft Office Excel 2010 程序处理。SPSS 19.0 软件被用于统计分析，并通过单变量方差分析在P＜0.05 的水平进行显著性差异分析。此外，本项研究目的在于建立3 种红豆杉茎段腋芽启动组培繁育技术体系，所以对于茎段腋芽启动率和增殖系数的统计和计算是基于所有红豆杉腋芽和不定芽的接种个数。由于生根实验中，只有东北红豆杉不定芽可以生根，所以生根率的统计和计算是基于东北红豆杉不定芽的接种个数。

2 结果与分析

2.1 不同植物激素组合对3种红豆杉茎段腋芽启动生长的影响

如图1（A）所示，带腋芽的茎段在添加固定浓度生长素NAA（1.0 mg·L-1）的MS 培养基中，随着细胞分裂素6-BA 的浓度从0.1 mg·L-1增加到1.0 mg·L-1，其启动率逐渐从2.83%升高到43.08%；当MS 培养基中6-BA 的浓度固定为1.0 mg·L-1，随着NAA 的浓度从1.0 mg·L-1减少到0.1 mg·L-1，茎段腋芽的启动率逐渐从45.92%升高到97.07%，并确定MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 为3 种红豆杉茎段腋芽启动的最佳培养基。如图1B 所示，将3 种红豆杉带腋芽的茎段外植体接种在上述最佳启动培养基上培养30 天，均可高效促使腋芽的萌动和生长。

2.2 不同植物激素组合对于3种红豆杉不定芽增殖的影响

启动后的红豆杉腋芽需要经过增殖培养来进行扩繁，我们将上一步成功启动的3种红豆杉腋芽从外植体上切割后转移到增殖培养基上进行扩增。如图2A 所示，当培养基中细胞分裂素6-BA的浓度固定为1.0 mg·L-1，随着生长素NAA 的浓度从0.1 mg·L-1增加到1.0 mg·L-1，红豆杉不定芽的增殖系数从0 升高到2.83；而当培养基中NAA 的浓度固定为1.0 mg·L-1，其增殖系数在6-BA浓度为0.4 mg·L-1时可达到最高为3.18。因此，本研究选取MS+0.4 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA 为3 种红豆杉不定芽增殖的最佳培养基。如图2B 所示，将启动后的3 种红豆杉腋芽接种在上述最佳增殖培养基上培养60 d，均可有效促进新的不定芽的出现和生长。

2.3 不同植物激素组合对3种红豆杉不定芽生根的影响

只有生根的红豆杉不定芽才是一个完整的植株，我们将上一步成功增殖的3种红豆杉不定芽切割后转移到生根培养基上进行诱导生根。在本实验研究的植物激素种类的浓度范围内，我们发现南方红豆杉和曼地亚红豆杉均未能出现生根，只有东北红豆杉可以有效生根。具体实验结果如图3A 所示，东北红豆杉不定芽在添加单一生长素（1.0 mg·L-1NAA 或1.0 mg·L-1IBA）的WPM 培养基中生根率差别显著，添加NAA 比添加IBA 的生根率提高了将近5倍；在两种生长素组合的培养基中，生根效果最佳的是添加0.8 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA 的培养基，比单一添加1.0 mg·L-1NAA的培养基生根率更高，可达8.15%，单个不定芽平均生根3条，且主根长度在3.0～3.5 cm。因此，本实验选定WPM+0.8 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA 为诱导东北红豆杉不定芽生根的最佳培养基。此外，我们发现红豆杉在生根过程中，其根上部分容易出现叶片脱落枯萎的现象。因此，我们将生根后的红豆杉不定芽转移到不含任何植物激素的WPM 培养基中进行培养，可实现其有效生长。如图3B 所示，将增殖后的东北红豆杉不定芽接种在上述最佳生根培养基上培养90 天，可有效诱导不定芽生根但不利于根上部位生长，转移到不含植物激素的培养基中，红豆杉茎叶生长状态可有效恢复且主侧根根系发达。

3 讨论

植物组织或器官在离体培养条件下往往缺乏合成细胞分裂素和生长素的能力［19，20］，为了在植物组织培养体系中实现细胞分裂、生长、形态分化等效果，需要在外植体生长、不定芽增殖、生根等阶段的培养基中添加不同种类、浓度和配比的植物生长素和细胞分裂素。根据以往的研究报道，细胞分裂素6-BA 和植物生长素NAA 对于植物不定芽的启动和增殖具有较好的效果［21］。因此，在本项研究工作中，我们选取了这两种植物激素进行不同浓度组合，以期实现对红豆杉腋芽的有效启动和增殖。此外，我们前期的预实验表明在MS基本培养基中添加不同浓度的6-BA 和NAA 可实现3 种红豆杉腋芽的启动和增殖，而WPM 培养基则有利于红豆杉不定芽的生根和后续无激素生长。因此，我们选定MS 培养基为红豆杉腋芽启动和增殖的基本培养基。WPM 培养基为诱导红豆杉不定芽生根的基本培养基。

植物枝条在向上生长过程中具有较强的顶端优势，其自身合成的天然生长素大量积累在侧芽，使得侧芽生长缓慢或休眠不生长。如图1A 所示，当培养基添加固定较高浓度的NAA 时，茎段外植体上腋芽的启动率随着6-BA 浓度的逐渐增加而升高；当培养基中添加固定较高浓度的6-BA 时，茎段外植体上腋芽的启动率随着NAA的浓度逐渐降低而显著升高。以上实验结果表明降低生长素NAA 浓度并且相对提高细胞分裂素6-BA 浓度有利于解除茎段顶端优势对腋芽生长的限制，可有效促进腋芽的启动生长。李慧等人在研究不同激素对银白杨叶片不定芽再生的影响中发现，当MS培养基中6-BA 和NAA 的浓度比为5∶1 时对于不定芽的诱导效果最佳，但随着NAA 的浓度继续升高时，诱导率则随之下降［22］，这与本实验研究结果较为一致。

茎段腋芽启动培养后，需要对所得不定芽进行增殖培养，以进一步扩大其数量和规模，以期实现有效扩繁。本研究发现，较高浓度的生长素有利于不定芽增殖，且在MS 培养基中添加一定浓度的细胞分裂素（0.4 mg·L-16-BA）对红豆杉不定芽增殖效果最佳。我们推测，在不定芽增殖培养时，培养基中高浓度的NAA可起到抑制顶端生长的作用（如图2B 中东北红豆杉和南方红豆杉主芽出现了枯萎的现象），而一定浓度的细胞分裂素可促进不定芽的发生，进而实现良好的增殖效果。孙珺等人在红豆杉愈伤组织的诱导培养的研究中发现，在1/2 MS 基本培养基的条件下，保持6-BA 浓度不变，且在一定浓度范围内，随着NAA浓度的增加，愈伤组织的增殖率也随之上升［23］，这和本实验研究结果较为一致。王冰等在研究东北红豆杉快繁技术时发现，培养基中生长素NAA 与高浓度的细胞分裂素6-BA 配比时其芽分化及生长的情况相对较好［24］。杨玲等在摸索云南红豆杉枝条离体快繁技术时发现，在含有2.0～3.0 mg·L-16-BA+1.0～2.0 mg·L-1IBA 或1.0～2.0 mg·L-1NAA 的B5 培养基上，芽可形成长势较好的枝条［25］。此外，师春娟和刘新星等概述了近年来针对红豆杉属植物主要的组织培养方法及其影响因素的研究成果，发现红豆杉属植物的组织培养方法不同于其它木本植物，不同的种类、培养材料、甚至同一品种的不同部位采用的培养基往往不相同。因此，目前红豆杉的离体组织培养条件没有统一的标准，红豆杉的组培繁育需要根据不同的目的、材料和方法相应地调整培养措施［26～27］。

不定芽成功增殖后，我们需要对不定芽进行生根培养，只有生根的不定芽才是完整的植株，才能有效实现红豆杉组培苗的繁育和栽培。相关研究表明，NAA 和IBA 对红豆杉不定芽生根均具有显著的促进作用［28～29］。在本实验研究的NAA 和IBA 浓度范围内，在一定时间的诱导期内（60～120天）我们发现只有东北红豆杉不定芽可以有效生根，而南方红豆杉和曼地亚红豆杉不定芽没有出现生根现象，这可能与不同种类红豆杉固有的内在遗传物质差异有关，进而使得各自驱动根形态发育建成所需植物激素种类和浓度以及所需培养时间不同所致。在后续研究中，我们将尝试更换植物激素类型和浓度或进一步延长培养时间，以期实现南方红豆杉和曼地亚红豆杉不定芽生根。同时，本研究还发现这两种生长素的组合比任何单一种类的生长素对诱导东北红豆杉不定芽生根效果要好，这可能与这两种激素在诱导生根时可发挥协同互补作用有关。此外，东北红豆杉诱导生根过程中出现了叶片脱落枯萎的现象，这可能归因于：不定芽生根后其自身合成植物激素的能力随之增强，而培养基中仍含有过高浓度的生长素，二者协同起来会对生根苗的生长产生抑制作用，进而导致叶片脱落枯萎。为了解决这一问题，我们将生根苗在后续培养过程中转移到不添加任何激素的WPM 培养基中，以此来消除过高植物激素对其生长引起的不利影响，事实也证明了这种举措确实产生了良好的效果，这体现了低浓度生长素促进植物生长而高浓度生长素抑制植物生长的双重性作用［30］。

4 结论

本研究选用我国特有的东北红豆杉、南方红豆杉和曼地亚红豆杉的带有腋芽的茎段组织为外植体，系统考察了其启动、增殖及生根过程中涉及的培养条件，在不同植物激素组合的启动培养基中确定了MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 为3种红豆杉腋芽的启动培养基；在不同植物激素组合的增殖培养基中确定了MS+0.4 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA 为3 种红豆杉不定芽的增殖培养基；在不同植物激素组合的生根培养基中确定了WPM+0.8 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA 为东北红豆杉不定芽的生根培养基，且不含任何植物激素的WPM 培养基为生根苗的最佳生长培养基。本项研究所建立的红豆杉茎段腋芽启动组培繁育技术操作简单、有效可靠、成本低且不受季节限制，可为我国红豆杉种质资源的保护和可持续利用提供有力的技术支撑。未来将致力于解决南方红豆杉和曼地亚红豆杉不定芽不生根的问题以及进一步提高这3 种红豆杉不定芽的增殖率和东北红豆杉的生根率，最终建立一整套高效的红豆杉繁育技术体系，以期实现我国红豆杉繁育相关产业的健康快速发展。