龙胆个体发育早期器官发育形态学研究

王文颖 王秋红 刘鸣远 孙 阎*

（1. 黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2. 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，哈尔滨 150025）

个体发育是有机体与所处环境相互作用的过程，这一过程中的胚胎发育、种子形成、种子萌发至种苗形成均是处于营养发育的早期阶段［1］，也是植物体根、茎、叶等器官分化的关键时期，应该成为探讨系统发生的重要依据。胚胎发育是从一个受精卵（合子）开始经过多次细胞分裂，反复分化直至发育成成熟胚的过程［2］，它是在相对封闭的子房中进行的，主要受内环境影响，有利于保存祖先的孑遗原始性状。种苗发育是从种子萌发至幼苗的形成过程，它是在开放的外界环境中进行的，主要受外环境影响，更多地体现后生性状。被子植物营养发育中的胚胎发育后期至种苗发育初期［3～5］，即从内环境主导向外环境主导转换阶段，是前人研究工作中最薄弱的环节［1，6～9］。就是说在个体发育全过程中的这一阶段还有一些重要的形态解剖学的信息亟待通过研究加以补充，这既是植物结构学的需要，也是了解植物个体发育全貌以及据此探讨系统发育及生态演化的需要。

龙胆（Gentiana scabraBunge）又称粗糙龙胆或龙胆草，为龙胆科（Gentianaceae）多年生草本植物，生于400～1 700 m 海拔的山坡草地、林缘及林下和草甸，见于我国东北、东部沿海和西南地区［10］。龙胆是黑龙江省优质地道中药材“关龙胆”的重要药源，以干燥根及根茎入药，有泻肝胆实火，清下焦湿热之功效［11］。近年来，由于过度采挖，分布区日益缩小，被列为濒危物种［12］。目前开展了相应的基础生物学研究工作［13～14］，尤其是解决了龙胆种子育苗难题（萌发需要高温高湿条件）［15］后其栽培规模逐渐扩大，适当缓解了龙胆草医药需求压力。在对龙胆后续生物学的研究工作中我们曾发现其胚后发育有一些值得注意的特点，如根端发育滞后，提前产生根环和根环毛，以种子萌发的根尖为材料很难得到好的染色体分裂相等［16～18］。而根端发育滞后［3，19］、形成根环和根环毛是大多水生植物的特点［4，7～8］。为什么陆生植物龙胆会有这种现象？均未见相关报道。为此，我们对龙胆合子至种苗的发育过程进行了研究，以进一步揭示在器官发育顺序及结构特点上鲜为人知的结构植物学问题。

1 材料与方法

1.1 材料

研究材料主要采自黑龙江省鹤岗市周边山区，经哈尔滨师范大学王臣教授鉴定为龙胆（Gentiana scabra），凭证标本（230405180822006LY）保存于黑龙江大学现代农业与生态环境学院植物标本室。

用于胚胎发育时期的材料，从龙胆的始花期到果期（8月20日～10月8日）进行取材，每隔3～5 d取材一次，每次取不同大小的子房各2～4 个，取材后迅速用FAA（配比：70%酒精90 mL，冰醋酸5 mL，福尔马林5 mL）固定并及时对材料进行抽气处理，在固定24 h后转入70%酒精中保存备用。

用于种子萌发观察的材料在龙胆果实成熟时进行收集。采集开裂的蒴果20 个左右（每个蒴果含种子约2 500 粒），去除杂质后的净种子自然干燥后放置于4℃冰箱保存。

用于电镜扫描的材料则是取整个萌发的种子（种苗）进行固定。将材料置于2.5%戊二醛中固定，并缓慢抽气使材料下沉，之后用0.1% mol·L-1的磷酸缓冲液3次，每次5 min，再经梯度浓度乙醇脱水（50%、70%、80%、90%、95%、100%），每一级脱水15 min。随后用乙酸异戊酯置换，临界点干燥法干燥后获得样品材料。干燥的样品材料用双面胶粘于样品台上，并在离子溅射仪Eiko IB-3 中进行导电处理，制成待观察样品。

1.2 方法

取一定量的种子置于带两层滤纸的培养皿（φ=90 mm）内，在室温条件下进行发芽实验。借助体视显微镜每天观察种子萌发状况后，取不同萌发过程的种子（种苗）经FAA（配比：50%酒精90 mL，冰醋酸5 mL，福尔马林5 mL）固定24 h 后转入70%酒精内保存备用。同时将一部分种子直播于带土的花盆中，观察种苗发育形态特征，并在北京泰克XTS-20体式显微镜下拍照。

不同发育时期的子房和萌发的种子材料固定处理后，利用常规石蜡切片技术切片，苏木精整染及番红复染，切片厚度8～12 μm。制成的装片镜检后在LEICA-DM 4000 B LED 显微镜下观察拍照。

制备好的电镜扫描样品材料最后在HITACHI S-4800 型扫描电子显微镜下观察、拍照和记录，加速电压15 kV。

2 结果与分析

2.1 原胚发育特征

胚的发育从合子分裂开始，位于胚囊珠孔端的合子（见图1：A）近圆形，细胞核体积较大，位于细胞中部，核仁明显，细胞质浓厚。合子经历近3 d的休眠期后才开始有丝分裂，进入原胚发育时期。合子第一次横向分裂，产生一个近珠孔端的体积较大的基细胞（bc）和一个近合点端的体积较小的顶细胞（ac），基细胞和顶细胞共同组成2-细胞原胚（见图1：B）。之后，基细胞和顶细胞再分别进行一次横向分裂，分化为线形排列的4-细胞原胚（见图1：C）。4-细胞原胚形成之后，近合点端的两个细胞又进行了一次横向分裂，形成线形排列的6-细胞原胚（见图1：D）。接下来，靠近合点端的两个细胞进行斜分裂，形成8-细胞原胚（见图1：E）。随后合点端的4个细胞通过多次的平周分裂，原胚体积不断增大，表皮细胞分化明显，发育为棒形胚（见图1：F）、球形胚（见图1：G）。随着子叶原原基的分化，相继构成了心形胚（见图1：H）和鱼雷胚（见图1：I）。与此同时，2-细胞原胚时的基细胞，通过横向分裂，形成单向排列的3～6 个胚柄细胞，与靠珠孔端的大孢子壁相连，其形态大小在鱼雷胚时变小，呈现出一定的退化趋势（见图1：C～J）。因此，胚的发育模式属于茄型胚（Solanad type）［20～21］。另一方面，初生胚乳核在2-细胞和4-细胞原胚时期，离原胚较远，到了8-细胞原胚时，随着细胞分裂增殖，以游离核构成的胚乳合胞体靠近并包围初生球形胚，到了球形胚时期胚乳细胞分化出明显的细胞壁，形成了胚乳细胞（见图1：G），因此，发育模式符合核型胚乳［20～21］。到了心形胚和鱼雷胚阶段，原胚周围的胚乳细胞被逐步吸收，原胚和胚乳体之间形成一圈明显的空隙，没有观察到胚乳吸器（见图1：H～J）。

种子自开裂蒴果散落时，种子胚的分化不完全，大部分处于鱼雷胚时期，胚乳细胞中也积累较多的内含物，此时胚周围的部分胚乳细胞解体（见图1：I），被胚所吸收。

2.2 种子萌发及器官分化过程

龙胆种子萌发前经过形态后熟发育至成熟胚时期，其种子室温浸水2 d 后，首先是胚体周围胚乳逐渐水解成可吸收的液态（见图2：A）；胚体吸收周围的养分继而两片子叶逐渐加厚，长成长椭圆形，胚轴伸长，根端也开始分化（见图2：B～C），此阶段胚芽也未见发育（见图2：B～C）。至第五天时可见胚根从种皮外的翅中伸出，主要是由下胚轴细胞持续生长使胚根的根端自种孔突破种皮，根端初步分化（见图2：D）。胚根突破种皮后，在胚根和下胚轴的交界位置，接近下胚轴末端的细胞向外膨大形成一个环状凸起，即根环（root collar）（见图2：D～E）。随后根环区域细胞外凸形成根环毛（collet hairs），在纵轴上可见根环毛由根环处的2～5 层表皮细胞外凸发育而成（见图2：F～I），其长度逐渐超过胚根（见图3：C～E）。这圈毛发生时可见胚根的根尖并未完全发育，明显早于根毛的发育，所以不是根毛结构，因其由根环的表皮细胞外凸形成，故称之为根环毛，亦称下胚轴毛。根环毛较为密集，其细胞核常位于基部至中部（见图2：H），这也与根毛完全不同，但根环毛在外形上与根毛类似（见图2：J），均是表皮细胞外凸形成的管状结构。

种苗子叶脱离种皮时，根环处的根环毛较为密集，包围着胚根，并且长度甚至超过胚根，胚根先端虽然主要为分生细胞组成，但尚未见根尖分生区明显分化。这些密集的根环毛常常伸入周围介质中，明显起到固定种苗的作用，这也使得平卧的种苗逐渐转为直立状态进行生长，此时根端的分生区细胞开始分化，正常根毛出现（见图2：J）。

为了进一步了解龙胆的种子萌发形态学特征，利用扫描电镜观察了它们的萌发过程，结果如下。浸水第5 天可见下胚轴伸长使胚根突破种皮（见图3：A），根端初步分化，并在下胚轴和胚根交界处出现呈环状膨大的根环（见图3：B，F），随后根环处的表皮细胞外凸延长形成管状的根环毛（见图3：C～D，G），多而密集的根环毛包围圆锥状的胚根，此阶段的胚根初步发育，其长度的增加主要靠分生区细胞数量增多来实现的，先端可见根冠结构。随着种苗的进一步发育，胚根发育较快，其内部成熟组织出现，成熟区正常发育的根毛出现，此时的根环毛依旧保存完好（见图3：E，H）。幼苗的根环毛刚出现后，子叶上的气孔也逐渐发育可见（见图3：I）。

子叶展开变绿时，也未见胚芽发育，但根发育较快（见图4：A）。至第一对真叶可见时（见图4：B），子叶状态的种苗已经停留10 d有余，但其地下的胚根则持续生长，说明其苗端发育相对停滞。但在地上停滞发育的同时，地下的胚根（主根）在根端分生组织的作用下逐渐伸长，随着正常根毛的出现，根环毛也逐渐萎缩（退化）（见图4：A）。

3 讨论

龙胆胚和胚乳的发育过程与已报道的龙胆属（Gentiana（Tourn.）L.）胚胎学特征基本一致［22～24］，如种子含丰富的胚乳，胚乳发育为核型，胚的发育为茄型等。但是龙胆4-细胞原胚时期之后的第三次分裂不是4个细胞全部横裂，而只有来源于顶细胞的两个细胞进行横裂，形成6-细胞原胚（见图1：D）。这与龙胆属的东北龙胆［22］、秦艽［25］、线叶龙胆［23］、以及条纹龙胆［24］相似，而与黑边假龙胆［26］、喉毛花［27］和湿生扁蕾［28］不同，后三种植物的4-细胞原胚第三次分裂是4 个细胞全部横裂形成8-细胞原胚。这样的发育特性是否具有系统学意义，有待进一步研究评价［29］。

另外，龙胆种子离开母体时胚体的发育程度并不是球形胚阶段，主要是心形胚和鱼雷胚时期，因此，前人总结的龙胆属胚胎学特征中关于“当种子散落时胚只发育至球形胚阶段”［23］这一特点应该扩展至心形胚和鱼雷胚阶段。也就是说龙胆种子成熟时，其胚芽和胚根尚未分化，萌发前的种子其胚体需要进行形态后熟过程，丰富的胚乳中的内含物是这一过程完成的有利保障。

植物的根环和根环毛是最初在研究龙胆时发现的，主要是种子在地面萌发后看见的，但当时未对下胚轴末端这一环状分布的长而密的毛给予重视，后来在根系发生与发展的研究时发现这圈毛在一些种类中也存在。随后查阅文献获知，根环和根环毛在水、湿环境中的被子植物中是比较常见的原始性状，如芡实［1］、泽泻［3］、大花睡莲［7］、慈姑［19］和龙舌草［30］等。并且这圈毛最初被误认为是“根毛”［31］，后来根据其出现的时间和位置被界定为“下胚轴毛”［19，32］，而这圈毛是根环细胞外凸形成，根据根环的位置和已有研究报道［8，33～34］，今后称之为“根环毛”将更为准确。也就是说水生被子植物种子萌发时一般都是在下胚轴末端产生根环和根环毛，并且苗端先发育，根端后发育，这些性状应该可以作为判断水生起源的特征组，是原始的遗传性状。正如陆生哺乳动物胚胎发育中出现的鳃裂，在演化上意味着其祖先曾经是水生的，而成体未见鳃裂并不等于它在系统发育中一直是陆生的，通过个体发育全面系统的研究，仍可根据早期出现的鳃裂作出判断，在系统发生上先是水生，而陆生是后来发生的。看来，至少在上述个例的某些性状上，被子植物营养发育也有重复系统发育的表现。另外，根环和根环毛的发育也是受特定基因调控的，其出现的密度和长度显然更利于种苗初期固定于泥土之上，也使得种苗由平卧变为直立生长。根环毛的细胞核通常位于毛的基部至中部，似乎是个动态变化的过程，其是否具有类似于根毛的吸收作用，还有待进一步验证。

龙胆自然分布于山坡草地、灌丛中、林缘及林下、草甸等，是偏旱的自然生态环境。其种子地面萌发，需要高温高湿的环境，并且萌发时产生根环和根环毛以及莲座状的种苗适当耐水淹等，这些特点皆与水环境密切相关，应该是水生祖先孑遗性状得以保留的表型特征，并不是简单的适应性状。龙胆的种子在成熟胚阶段胚根的根端已初步分化，而苗端未见分化；种苗发育中根端入土发育成初生根，初生根产生分枝后，才有真叶的产生；幼苗无通气组织，具完整的输导组织，具气孔和明显加厚的角质层等，这些性状显然又反映其对现代偏旱环境的协调发展。总之，从生态演化的观点来看，龙胆的早期营养发育，既反映其祖先的水生孑遗原始性状，又反映了对现存偏旱生境的适应，它应该是水生起源的，是次生陆生的进一步演化。