结合QTL-seq和连锁分析发掘水稻中胚轴伸长相关QTL

刘 畅 孟 云 刘金栋 王雅美,* Guoyou Ye,2

研究简报

结合QTL-seq和连锁分析发掘水稻中胚轴伸长相关QTL

刘 畅1孟 云1刘金栋1王雅美1,*Guoyou Ye1,2

1中国农业科学院深圳农业基因组研究所, 广东深圳 518120;2国际水稻研究所, 菲律宾马尼拉 DAPO Box 7777

中胚轴长度(mesocotyl length, ML)是影响旱直播水稻出苗和早期幼苗活力的重要性状。发掘中胚轴伸长相关位点, 解析其遗传机制, 选育长中胚轴品种是促进旱直播技术推广最为经济和有效的方式。本研究以长中胚轴品种‘Changai’和短中胚轴品种‘IR 145’为亲本构建的F2遗传分离群体为材料, 构建长池和短池并开展深度重测序(50×)。利用Δ(SNP-index)和G-value两种方法在3号染色体29.56~33.28 Mb处鉴定到1个中胚轴伸长相关位点。在候选区域开发KASP标记, 对184个F2株系开展连锁分析, 将候选区间缩小到28.89~31.03 Mb。结合基因注释、连锁分析和基因表达分析结果, 推测和为候选基因。这些基因分别与植物激素的调控和细胞分裂相关机制有关。本研究发掘了一个水稻中胚轴伸长相关位点, 对选育长中胚轴品种有一定帮助。

中胚轴; 混合分组分析法; Δ(SNP-index); 连锁分析; 候选基因

水稻是我国主要的粮食作物之一, 传统的水稻栽培方式以育秧移栽为主。近年来, 随着劳动力成本的快速提高, 无需育秧移栽、节省大量人力和水资源的旱直播技术逐步成为我国水稻生产的发展方向[1-3]。然而, 旱直播水稻面临的出苗率低、出苗不齐、生长势差等问题长期无法解决。当前我国多数推广水稻品种和骨干亲本不适宜于旱直播[4]。在种子萌发过程中, 位于幼苗胚芽鞘节与胚根基部之间的中胚轴组织的伸长有助于水稻在土壤深处或水下播种时的成苗, 提高出苗的整齐度和生长势, 是旱直播水稻应用的关键性状[5-7]。因此, 发掘控制中胚轴伸长相关基因, 筛选和创制长中胚轴种质, 对培育适于旱直播的新品种, 促进旱直播技术的推广具有重要意义。

水稻中胚轴长度(mesocotyl length, ML)是一种由多基因控制的数量遗传性状[8]。数量遗传性状基因挖掘的传统方法是利用双亲分离群体, 构建高密度、均匀分布、覆盖全基因组的分子标记连锁图, 结合表型数据来定位控制目标性状的数量性状基因位点(quantitive trait loci, QTL)。已有部分研究通过QTL定位和全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)的方法, 发掘了50余个水稻中胚轴伸长相关位点, 在12条染色体上均有分布[9-11]。近年来关于中胚轴伸长相关的遗传机制已有报道。Xiong等[8]发现乙烯(ethylene, ETH)可通过抑制基因的表达、控制茉莉酸(jasmonic acid, JA)的生物合成来调控中胚轴的伸长。Zhao等[12]发现2个控制中胚轴伸长的基因,和, 在长中胚轴材料中的表达量显著低于短中胚轴材料。Sun等[13]发现基因可通过协调独脚金内酯(strigolactone, SL)和油菜素内酯(brassinolide, BR)的信号转导来调节中胚轴的伸长。Zheng等[14]发现Karrikin信号通路与BR信号通路可共同调控中胚轴的伸长。

多数农艺性状为多基因控制的数量遗传性状[15-17], 其遗传机制复杂, 发掘目标性状控制位点, 并解析其遗传机制, 选育优良目标品种, 一直是困扰遗传学家和育种家的难题。传统的连锁分析和GWAS方法均需要通过SSR、SNP芯片或重测序的方式针对遗传群体所有材料开展基因型检测, 耗费大量人力、物力和时间。混合分组分析法(bulked segregant analysis, BSA)是一种基于目标性状差异,在研究群体中选择一定量的个体(20~50个)并提取DNA, 等量混合构建混池, 以进行基因型分析的方法[18]。DNA混池间存在多态性的标记, 则可看作与目标性状基因关联。BSA法不需要对每个单株进行基因分型, 可快速检测出与目的基因紧密连锁的标记, 能够节约大量成本, 有效提升效率, 在水稻、玉米、小麦、油菜等多种农作物数量性状基因的定位研究中起着非常重要的作用[19-23]。结合BSA和二代测序技术(next generation sequencing, NGS)的QTL-seq技术结合了两者的优点, 可低成本、快速和高效地确定目标QTL。KASP技术是基于PCR的高通量SNP分型技术, 可基于特定群体的变异信息, 在目标区域开发特异标记, 快速完成基因型检测。KASP技术发展迅速, 在农艺性状QTL定位中发挥了重要的作用。将QTL-seq与基于KASP标记的连锁分析相结合的策略, 在作物数量性状基因挖掘研究中已得到应用[24-26]。Lu等[25]利用QTL-seq定位到一个控制黄瓜早花性状的主效QTL (), 结合遗传连锁分析, 将其定位在一个890 kb的基因组区域, 并推测为候选基因。Das等[16]将QTL-seq与传统QTL定位相结合, 把控制鹰嘴豆千粒重的QTL ()区域由1.37 Mb缩小到35 kb范围内。Wang等[24]在F2群体中利用QTL-seq将控制甘蓝型油菜分枝角度的QTL定位在6号染色体17.74~18.32 Mb之间。

相较于传统的连锁分析和GWAS分析, QTL-seq可快速、高效地发掘控制作物重要农艺性状的遗传位点, 在数量基因发掘领域已有较为成熟的应用[27-29]。尽管中胚轴相关遗传研究已有部分报道, 但已发掘的遗传位点仍不能满足当前长中胚轴育种的需求。因此, 发掘新的中胚轴伸长相关QTL, 针对目标QTL开发可用分子标记对于深入探究水稻中胚轴伸长机制, 创制长中胚轴种质十分必要。本研究采用前期筛选到的长中胚轴品种‘Changai’与短中胚轴品种‘IR 145’构建的F2群体为材料, 利用QTL-seq和区间连锁分析相结合的方法, 发掘控制中胚轴伸长的基因组区段及目标基因, 解析中胚轴伸长遗传机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以短中胚轴材料‘IR 145’ (0.18 cm)为母本, 长中胚轴材料‘Changai’ (4.75 cm)为父本, 于2018年6月配制杂交组合, 收获F1代种子后, 同年12月在海南试验基地进行南繁加代, 2019年4月单株采收获得F2代种子。

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗培养与中胚轴长度测定 挑选720粒饱满无开裂的种子, 播种于装有定量均质营养土的10×5孔穴盘内, 每孔深度9.5 cm, 上层直径4.5 cm, 底层直径2.1 cm, 每穴孔内播种15粒, 共计播种48穴, 其余两穴种植亲本, 确保籽粒间无互相挤压并覆盖营养土至与穴孔表面平齐。称取500 g营养土至托盘内并压实, 将穴盘置于托盘内, 取适量纯净水分别喷洒穴盘与托盘, 并将其置于30℃恒温黑暗培养箱内培养。每日定时浇水至出苗, 并记载发芽情况。恒温培养7 d, 将穴盘从人工气候箱中取出, 以流动水冲洗幼苗根部营养土。去除长势较差单株, 选取均匀一致株系照相并利用ImageJ测量中胚轴长度。

1.2.2 混池测序 基于双亲本及F2分离群体的中胚轴长度构建极长和极短混池。具体方式如下, 由F2群体中分别选取50株极长和极短株系, 采用CTAB法提取单株DNA, 并等量混合形成长池和短池。基于Illumina HiSeq 2500平台(北京贝瑞和康生物技术有限公司)对双亲本和极端池进行高深度(50×)全基因组重测序(PE150)。

1.2.3 数据分析 将测序得到的raw reads进行质控获得clean reads。质控原则如下: (1) 去除含接头的reads; (2) 去除N比例大于10%的reads; (3) 去除低质量reads (质量值Q≤3的碱基数占整个read的50%以上)。利用BWA软件将clean reads与日本晴参考基因组RGAP7 (Rice Genome Annotation Project, MSU)进行比对。采用GATK (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us)推荐算法发掘SNP (single nucleotide polymorphism)和InDel (insertion- deletion)位点。获得SNP和InDel信息后, 以‘IR 145’作为参考等位基因, 采用滑动窗口策略来绘制2个子代混合池的SNP-index图(以1 Mb为窗口, 10 kb为步长), 并过滤掉1 Mb范围内小于10个SNP位点的区域。为了减少测序和比对错误的影响, 同时过滤掉子代SNP-index都小于0.3和SNP深度小于6的位点。得到2个子代混合池的SNP-index图后, 计算分离位点在子代2个极端池之间基因频率的差值Δ(SNP-index), 并进行1000次置换检验, 选取99%置信水平作为阈值, 超过阈值外的区域为潜在的QTL候选区域。同时, 计算该群体的-value来验证以上结果。Δ(SNP-index)和-value分析由基于R语言的QTL-seqr包进行[30]。

1.2.4 竞争性等位基因特异性PCR (kompetitive allele specific PCR, KASP)标记检测 选取184个长势正常的F2单株进行中胚轴长度测定。根据由QTL-seq研究中获得的置信区间内的SNP位点和侧翼序列设计PCR扩增引物, 开发KASP分子标记。同时, 为规避遗传背景影响, 其他每条染色体设计6个KASP标记作为背景标记。每个标记设计2条SNP特异性引物(F1/F2)和一条通用引物(R), F1尾部添加能够与FAM荧光结合的特异性序列(5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′), F2尾部添加能够与HEX荧光结合的特异性序列(5′-GAAGGTCGGAGT CAACGGATT-3′)。引物序列见附表1 (未展示序列标记由长沙华智生物技术有限公司提供)。按照LGC (https:// www.lgcgroup.com/)提供的标准方法设计KASP引物, 由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用CTAB法提取对应单株叶片的DNA, 委托长沙华智生物技术有限公司对质检合格的DNA样品进行KASP标记检测。KASP扩增反应体系为10 μL, 具体为: 5 μL 2 × KASP Master Mix, 0.14 μL KASP Primer Mix, 1.0 μL模板DNA (60 ng μL–1), 3.86 μL ddH2O。KASP反应程序为: 94℃热处理15 min; 94℃变性20 s, 61℃退火和延伸60 s, 10个循环(每循环降低0.6℃); 94℃变性20 s, 55℃退火和延伸60 s, 26个循环; 4℃避光保存。

1.2.5 遗传图谱构建及QTL鉴定 根据两亲本序列信息, 在利用QTL-seq发掘到的置信区间及其他背景染色体(每条染色体开发6个)设计KASP荧光标记, 在F2群体中选择184个株系开展基因型检测。与母本型相同的标记记为“2”, 与父本型相同的标记记为“0”, 杂合带型的标记记为“1”, 模糊或缺失带型的标记记为“−1”。选取分型准确且非偏分离的KASP标记, 采用JoinMap v4.0基于Kosambi函数计算遗传距离[31], 构建遗传连锁图。利用ICI Mapping v4.2的复合区间作图法(inclusive composite interval mapping, ICIM)[32]进行QTL分析, 将LOD值2.5作为判断QTL存在的阈值。

1.2.6 表型数据分析 利用Microsoft Excel 2019对Changai/IR 145 F2群体的中胚轴长度进行基本统计量分析。

1.2.7 连锁区域候选基因预测和表达量分析 水稻中胚轴伸长受到多种植物激素的调控, 如JA[8]、SL[13]、BR[13]、赤霉素(gibberellin, GA)[33]、生长素(auxin, IAA)[34-35]、ETH[8,33]、脱落酸(abscisic acid, ABA)[36]和细胞分裂素(cytokinin, CTK)[37]。基于QTL-seq分析和连锁定位结果, 结合基因注释信息, 初步确定候选基因清单(附表2)。于第8天取亲本‘IR 145’和‘Changai’幼苗的中胚轴组织用于表达量检测。采用TRIzol法提取总RNA并检测总RNA浓度和纯度, 根据纯度数值选取优质RNA样品并根据浓度值确定RNA模板加样量。依照Thermo Scientific公司提供的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒反转合成20 μL cDNA。将cDNA模板用无菌双蒸水稀释5~10倍, 按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒要求配制qPCR反应体系, 在Step One Plus实时定量PCR仪器运行反应, 使用2-ΔΔCT运算方式进行基因表达水平数据分析。每个样品设置3次重复, 以、和管家基因为内参基因对基因表达数据归一化分析, 计算候选基因在‘IR 145’和‘Changai’的相对表达量。

红色标识处为对应品种中胚轴部位。左侧为‘IR 145’, 中胚轴长度为0.18 cm左右。右侧为‘Changai’,中胚轴长度为4.75 cm左右。

The mesocotyl section is marked by red mark. The left is ‘IR 145’ with a mesocotyl length of about 0.18 cm. The right is ‘Changai’ with a mesocotyl length of about 4.75 cm.

2 结果与分析

2.1 亲本及F2分离群体的表型测定

在30℃条件下黑暗培养7 d后, ‘IR 145’的中胚轴长度为0.18 cm, ‘Changai’的中胚轴长度为4.75 cm (图1), 中胚轴长度呈极显著差异(< 0.01)。在IR 145/Changai F2群体中, 中胚轴长度呈正态分布(图2)。以上结果表明水稻中胚轴长度是一种典型的由多基因控制的数量遗传性状。

2.2 混池测序结果

2.2.1 测序质量分析 对从F2群体中选择的50个长中胚轴单株和50个短中胚轴单株分别构建混池并开展高深度(50×)重测序。对原始测序数据进行质控后共计获得数据107.9 Gb, 平均测序深度分别为51.32× (Changai), 47.49× (IR 145), 57.83× (长池)和66.53× (短池) (附表3)。将4个样本的clean reads分别与日本晴参考基因组进行比对, 发现平均比对效率均在97.32%以上。测序数据质量合格, 可用于后续变异检测与分析。

2.2.2 变异检测及候选区间分析 将2个极端池的clean reads与‘IR 145’参考基因组进行比对后, 共计检测到7,021,541个SNP。计算每个位点的SNP-index并过滤掉低质量的SNP, 最终获得3,267,590个高质量SNP位点。根据SNP频率, 对SNP-index在染色体上的分布进行作图。以1 Mb为单位窗口, 10 kb为步长, 计算窗口内的SNP-index平均值来反映子代的SNP-index分布并绘制分布图。将长池与短池所有SNP位点的2个SNP-index相减得到∆(SNP-index)值 (图3)。以95%置信水平作为关联染色体区域的筛选阈值, 在3号染色体鉴定出一个中胚轴伸长相关候选区域(29.56~33.28 Mb), 区间总长为3.72 Mb, 顶点位于31.29 Mb处(图3-A)。-value分析也显示该区间为显著关联区域(图3-B)。

X轴表示F2群体中胚轴长度, 分为0.18~1.21, 1.21~2.23, 2.23~3.26, 3.26~4.29 和4.29~5.32 cm 5个水平。Y轴表示各个水平的个体数。

The X-axis represents the mesocotyl length of the F2population, which is divided into five levels: 0.18–1.21, 1.21–2.23, 2.23–3.26, 3.26–4.29, and 4.29–5.32 cm. The Y-axis denotes the number of individuals at each level.

A: Δ(SNP-index)在水稻12条染色体上的分布, 其中, 红色和绿色代表的置信区间为95%和99%; B:-value在12条染色体上的分布, 阈值为FDR < 0.01.

A: the distribution of ∆(SNP-index) is on 12 chromosomes in rice, and the confidence interval are 95% (red) and 99% (green), respectively; B: the distribution of-value is on 12 chromosomes with the interval of FDR < 0.01 in rice.

2.3 遗传连锁图谱构建及QTL分析

基于亲本及极端池之间的SNP信息开发KASP标记。经过分型质量和偏分离检测后, 共计74个标记可用于后续群体基因型检测, 其中包含12个置信区间内标记和62个背景标记(附表1)。利用在亲本间存在多态性的74个标记对184个F2代单株进行SNP检测。利用ICI Mapping v4.2的ICIM法对中胚轴长度进行QTL定位。在3号染色体上检测到一个中胚轴长度相关的QTL位点, 位于标记28,890,281~31,027,370之间, LOD值为2.65, 可解释表型变异的8.82% (图4)。

左侧为3号染色体KASP标记遗传图谱, 右侧为对应LOD曲线, LOD阈值设为2.5。

The genetic map constructed by KASP markers is on the left, whereas the corresponding LOD curve (LOD > 2.5) is on the right.

2.4 候选基因注释及表达量分析

基于QTL-seq和连锁分析结果, 结合日本晴基因组注释信息, 初步筛选获得14个候选基因(附表2)。采用qRT-PCR对上述基因进行表达模式验证(图5和附图1)。结果表明,、和在长中胚轴品种‘Changai’和短中胚轴品种‘IR 145’中的表达量呈现显著差异(< 0.05) (表1)。其中()和()在长中胚轴品种‘Changai’表达水平显著高于短中胚轴品种‘IR 145’; 表明()和()参与并正调控中胚轴伸长。另外5个基因包括()、()、及2个同系物(、、), 在长中胚轴品种‘Changai’表达水平显著低于短中胚轴品种‘IR 145’, 表明该5个基因参与并负调控中胚轴伸长。

3 讨论

旱直播在多数水稻种植国家已得到大面积推广, 是水稻生产的重要发展方向。解析水稻中胚轴伸长遗传机制,对选育直播稻具有重要作用。当前, 水稻直播出苗相关因素的研究已有较多报道, 且已发掘部分中胚轴伸长相关位点, 为培育直播水稻品种提供了参考。但是, 当前已发掘位点依然无法满足水稻直播育种的需求, 发掘新的位点及其连锁标记, 对于解析中胚轴伸长遗传机制, 选育直播水稻具有重要作用。本研究以‘IR 145’和‘Changai’2个中胚轴极端材料构建F2群体, 结合QTL-seq和连锁分析, 高效快速地发掘水稻中胚轴伸长相关基因, 为创制长中胚轴优异种质提供了材料。

本试验利用‘Changai’与‘IR 145’构建的F2分离群体进行QTL-seq分析, 在3号染色体上定位到了一个中胚轴发育相关的QTL(29.56~33.28 Mb)。对该位点进行标记开发并扫描F2分离群体, 将区间缩小至28.89~31.03 Mb。本研究表明结合QTL-seq与连锁分析可快速解析数量性状遗传基础。随着测序成本的迅速降低, 该策略的应用将会更加广泛。中胚轴的伸长除受环境及植物激素的影响外, 还受自身遗传因素的影响。目前, 已从多个遗传群体中定位到了数十个与水稻中胚轴长度相关的QTL。其中, 3号染色体含有多个控制水稻中胚轴伸长的位点, 且在多个研究中均检测到(附表4)。Redona和Mackill[38]利用Labelle和Black Gora的F2群体检测到5个控制中胚轴长度的QTL, 分别位于1号、3号、5号和7号染色体上。Katsuta-Seki等[39]利用Daorenqiao和Surjumkhi的F2:3家系, 在3号、6号和11号染色体上定位了3个控制中胚轴长度的QTL。曹立勇等[9]利用籼稻IR64和粳稻Azucena杂交的F1代花粉离体培养获得的DH群体, 定位了控制中胚轴长度的8个QTL, 分别位于1号、3号、6号、7号、8号和12号染色体上。Wu等[40]利用GWAS在1号、3号、4号、5号、6号和9号染色体上均定位到与中胚轴伸长相关的QTL, 其中, 3号染色体上来自Kasalath的等位位点贡献率高达37.6%。Lee等[15]用Kasalath/Nipponbare构建的97个回交重组自交系对中胚轴长度进行QTL定位, 检测到、和三个位点, 其中在2个重复中均存在。Zhao等[12]利用GWAS在3号和7号染色体上发现2个控制中胚轴伸长的基因和, 并证明两基因在长中胚轴材料中的表达量显著低于短中胚轴材料, 其调控机理尚不明确。Liu等[10]利用207份东南亚和我国籼稻种质, 采用5种不同的基质环境, 在染色体上(除10号、11号染色体外)发掘到16个遗传位点, 分别解释6.3%~ 15.9%的表型变异。本研究在3号染色体上检测到的位点位于28.89~31.03 Mb处, 与Zhao等[12]和Lee等[15]发现的QTL位于同一区域。是一个在多项研究中均发现的中胚轴伸长相关稳定QTL位点。

中胚轴伸长受到多种植物激素的调控。JA和SL抑制中胚轴伸长, BR低浓度和高浓度分别促进和抑制中胚轴伸长, GA、IAA、ETH、ABA和CK促进中胚轴伸长。其中, ETH是通过抑制JA的合成来促进中胚轴伸长, SL和CK拮抗调节中胚轴伸长, ETH、ABA和GA三者协同促进中胚轴伸长。目前, 报道克隆的基因均与激素调控相关, 分别是、和(附表5)。研究发现,作用于介导的乙烯信号转导途径的下游以调节中胚轴的伸长, 通过促进JA合成相关基因的表达抑制中胚轴的伸长[8]。通过协调SL和BR信号传导来调控中胚轴的伸长。其中, BR通过抑制对细胞周期蛋白CYC U2的磷酸化以促进中胚轴伸长。此外, BR还能通过增强相关基因的表达, 如促进细胞有丝分裂基因、缩短细胞周期基因等, 来增强细胞分裂。SL通过F-box蛋白D3降解被磷酸化的CYC U2来抑制中胚轴的伸长[13]。与TOPLESS-RELATED PROTEINs (TPRs)相互作用, 调节下游基因的表达以促进中胚轴的伸长[14]。GA则通过改变细胞微管的排列方向, 增强果胶甲酯化来促进细胞伸长, 进而促进中胚轴伸长[41]。IAA则主要上调细胞壁松弛酶活性, 使得细胞壁呈现持续松弛的状态, 通过细胞生长达到中胚轴伸长的效果[34-35,42]。ABA通过增强胚芽鞘节附近的细胞分裂, 抑制BR信号通路促进中胚轴伸长[43]。ETH通过抑制JA合成来促进中胚轴伸长[8]。

图A~N依次表示14个候选基因在‘IR 145’与‘Changai’中胚轴组织中的相对表达量。内参基因为GAPDH。、、、、、和在短中胚轴品种‘IR 145’和长中胚轴品种‘Changai’中的表达量呈现显著差异(< 0.05)。

Figure A–N shows the relative expression levels of 14 candidate genes in the mesocotyl tissues of ‘IR 145’ and ‘Changai’, respectively. The internal reference gene is. The relative expression levels of,,,,,, andwere significantly different between the short-mesocotyl variety ‘IR 145’ and long-mesocotyl variety ‘Changai’ at< 0.05.

表1 水稻中胚轴伸长相关候选基因

综合注释信息、QTL-seq、连锁分析和表达模式结果, 在定位区间内鉴定到7个候选基因, 分别为、和。其中,和在长中胚轴品种‘Changai’表达水平显著高于短中胚轴品种‘IR 145’, 表明和参与并正调控中胚轴伸长。隶属的TIFY家族是特异性参与调节植物发育和逆境反应多种生物进程, 该家族基因存在结合DNA的C2C2-GATA锌指结构, 又称GATA家族[44]。水稻GATA家族由20个基因构成, 蛋白序列分析发现/存在CCT结构域, 可被转录后差异剪接从而行使不同功能[45]。在水稻幼苗期表达量最高, 并参与光依赖基因调控和硝酸盐同化[46], 特定CCT结构域表明其具有潜在的调节抽穗时间的能力[47]。类纤维合成酶在雄蕊和胚根中特异性表达, 催化非纤维素基质多糖的合成, 促进原生及次生细胞壁的伸展[48]。细胞壁在细胞伸长扩张和形态形成中具有关键性作用, 松弛的细胞壁有利于中胚轴伸长, 有研究表明, 玉米中胚轴中特异性表达的类纤维合成酶通过增强细胞壁的伸展性调节中胚轴伸长[49-50]。

另外5个基因, 包括、、及2个同系物在长中胚轴品种‘Changai’表达水平显著低于短中胚轴品种‘IR 145’, 表明该5个基因参与并负调控中胚轴伸长。ERF亚家族B族的转录因子在胁迫环境下调控植物生长,过表达致使植物的发芽率下降、抑制和应激基因表达, 是植物生长的负调节因子[51]。在生长缺陷型过表达植株富集表达, 并受γ射线(gamma ray, GR)和离子束(ion beam, IB)强烈诱导[52-53]。吲哚作为种间和种内信号因子与水稻生长发育和防御系统的形成过程密切相关, 水稻有5个基因编码磷酸吲哚-3-甘油酶IGL, 其中(Os03g58300)是吲哚生物合成的真正的IGL。综上所述,鉴定出7个控制中胚轴伸长候选基因, 均是第一次被发现参与中胚轴发育且存在不同方式的调控机制。下一步将针对这7个基因开展遗传转化以确认其功能。

请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb.chinacrops. org/; 2) 中国知网http://www.cnki.net/; 3) 万方数据http://c. wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

[1] Zhao G, Fu J, Wang G, Ma P, Wu L, Wang J. Gibberellin-induced mesocotyl elongation in deep-sowing tolerant maize inbred line 3681-3684., 2010, 129: 87–91.

[2] Liu H, Hussain S, Zheng M, Peng S, Huang J, Cui K, Nie L. Dry direct-seeded rice as an alternative to transplanted-flooded rice in central China., 2015, 35: 285–294.

[3] Chen Z, Tang Y T, Zhou C, Xie S T, Xiao S, Baker A J M, Qiu R L. Mechanisms of Fe biofortification and mitigation of Cd accumulation in rice (L.) grown hydroponically with Fe chelate fertilization., 2017, 175: 275–285.

[4] Matloob A, Khaliq A, Chauhan B S. Weeds of direct-seeded rice in Asia: problems and opportunities., 2015, 130: 291–336.

[5] Turner F T, Chen C C, Bollich C N. Coleoptile and mesocotyl lengths in semidwarf rice seedlings., 1982, 22: 43–46.

[6] Chung N J. Elongation habit of mesocotyls and coleoptiles in weedy rice with high emergence ability in direct-seeding on dry paddy fields., 2010, 61: 911–917.

[7] Zhang H, Ma P, Zhao Z, Zhao G, Tian B, Wang J, Wang G. Mapping QTL controlling maize deep-seeding tolerance-related traits and confirmation of a major QTL for mesocotyl length., 2012, 124: 223–232.

[8] Xiong Q, Ma B, Lu X, Huang Y H, He S J, Yang C, Yin C C, Zhao H, Zhou Y, Zhang W K, Wang W S, Li Z K, Chen S Y, Zhang J S. Ethylene-inhibited jasmonic acid biosynthesis promotes mesocotyl/coleoptile elongation of etiolated rice seedlings., 2017, 29: 1053–1072.

[9] 曹立勇, 朱军, 颜启传, 何立斌, 魏兴华, 程式华. 水稻籼粳交DH群体幼苗中胚轴长度的QTLs定位和上位性分析. 中国水稻科学, 2002, 16(3): 24–27.

Cao L Y, Zhu J, Yan Q C, He L B, Wei X H, Cheng S H. Mapping QTLs with Epistasis for mesocotyl length in a DH population fromcross of rice ()., 2002, 16(3): 24–27 (in Chinese with English abstract).

[10] Liu H, Zhan J, Li J, Lu X, Liu J, Wang Y, Zhao Q, Ye G. Genome-wide association study (GWAS) for mesocotyl elongation in rice (L.) under multiple culture conditions., 2019, 11: 49–64.

[11] Zhan J, Lu X, Liu H, Zhao Q, Ye G. Mesocotyl elongation, an essential trait for dry-seeded rice (L.): a review of physiological and genetic basis., 2020, 251: 1–14.

[12] Zhao Y, Zhao W, Jiang C, Wang X, Xiong H, Todorovska E G, Yin Z, Chen Y, Wang X, Xie J, Pan Y, Rashid M A R, Zhang H, Li J, Li Z. Genetic architecture and candidate genes for deep-sowing tolerance in rice revealed by non-syn GWAS., 2018, 9: 332–345.

[13] Sun S, Wang T, Wang L, Li X, Jia Y, Liu C, Huang X, Xie W, Wang X. Natural selection of a GSK3 determines rice mesocotyl domestication by coordinating strigolactone and brassinosteroid signaling., 2018, 9: 2523–2535.

[14] Zheng J, Hong K, Zeng L, Wang L, Kang S, Qu M, Dai J, Zou L, Zhu L, Tang Z, Meng X, Wang B, Hu J, Zeng D, Zhao Y, Cui P, Wang Q, Qian Q, Wang Y, Li J, Xiong G. Karrikin signaling acts parallel to and additively with Strigolactone signaling to regulate rice mesocotyl elongation in darkness., 2020, 32: 2780–2805.

[15] Lee H S, Sasaki K, Kang J, Sato T, Song W, Ahn S. Mesocotyl elongation is essential for seedling emergence under deep- seeding condition in rice., 2017, 10: 32–42.

[16] Das S, Upadhyaya H D, Baiai D, Kujur A, Badoni S, Narnoliya L, Kumar V, Tripathi S, Gowda C L, Sharma S, Sube S, Tyagi A K, Parida S. Deploying QTL-seq for rapid delineation of a potential candidate gene underlying major trait-associated QTL in chickpea., 2015, 22: 193–203.

[17] Lee H S, Sasaki K, Higashitani A, Ahn S N, Sato T. Mapping and characterization of quantitative trait loci for mesocotyl elongation in rice (L.)., 2012, 5: 13–22.

[18] Zou C, Wang P, Xu Y. Bulked sample analysis in genetics, genomics and crop improvement., 2016, 14: 1941–1955.

[19] Sun J, Yang L, Wang J, Liu H, Zheng H, Xie D, Zhang M, Feng M, Jia Y, Zhao H, Zou D. Identification of a cold-tolerant locus in rice (L.) using bulked segregant analysis with a next-generation sequencing strategy., 2018, 11: 1–12.

[20] Farooqi M Q U, Ma S, Lee J K. Bulk segregant analysis for the improvement of drought resistance in maize (L.) inbred lines as revealed by SSR molecular markers., 2018, 13: 34–51.

[21] Xu X, Li Q, Ma Z, Fan J, Zhou Y. Molecular mapping of powdery mildew resistance genein Chinese wheat landrace Shangeda using RNA-seq with bulk segregant analysis., 2018, 38: 23–34.

[22] Li C, Ling F, Su G, Sun W, Liu H, Su Y, Xin Q. Location and mapping of the NCLB resistance genes in maize by bulked segregant analysis (BSA) using whole genome re-sequencing., 2020, 40: 1–12.

[23] Miao L, Chao H, Chen L, Wang H, Zhao W, Li B, Zhang L, Li H, Wang B, Li M. Stable and novel QTL identification and new insights into the genetic networks affecting seed fiber traits in., 2019, 132: 1761–1775.

[24] Wang H, Cheng H, Wang W, Liu J, Hao M, Mei D, Zhou R, Fu L, Hu Q. Identification ofas a candidate gene for branch angle inby QTL-seq., 2016, 6: 38493–38502.

[25] Lu H, Lin T, Klein J, Wang S, Qi J, Zhou Q, Sun J, Zhang Z, Weng Y, Huang S. QTL-seq identifies an early flowering QTL located nearin cucumber., 2014, 127: 1491–1499.

[26] Lei L, Zheng H, Bi Y, Yang L, Liu H, Wang J, Sun J, Zhao H, Li X, Li J, Lai Y, Zou D. Identification of a major QTL and candidate gene analysis of salt tolerance at the bud burst stage in rice (L.) using QTL-Seq and RNA-Seq., 2020, 13: 55–68.

[27] Ehrenreich I M, Torabi N, Jia Y, Kent J, Martis S, Shapiro J A, Gresham D, Caudy A A, Kruglyak L. Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants., 2020, 464: 1039–1042.

[28] Abe A, Shunichi K, Kentaro Y, Satoshi N, Hiroki T, Hiroyuki K, Hideo M, Kakoto Y, Chikako M, Muluneh T, Hideki I, Liliana C, Sophien K, Ryohei T. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap., 2012, 30: 174–178.

[29] Takagi H, Abe A, Yoshida K, Kosugi S, Natsume S, Mitsuoka C, Uemura A, Utsushi H, Tamiru M, Takuno S, Innan H, Cano L M, Kamoun S, Terauchi R. QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations., 2013, 74: 174–183.

[30] Mansfeld B N, Grumet R. QTLseqr: an R package for bulk segregant analysis with next-generation sequencing., 2018, 11: 1–5.

[31] Kosambi D D. The estimation of map distance from recombination values., 1943, 12: 172–175.

[32] Meng L, Li H, Zhang L, Wang J. QTL IciMapping: integrated software for genetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping in biparental populations., 2015, 3: 269–283.

[33] Watanabe H, Hase S, Saigusa M. Effects of the combined application of ethephon and gibberellin on growth of rice (L.) seedlings., 2007, 10: 468–472.

[34] Gray W M, Ostin A, Sandberg G, Romano C P, Estelle M. High temperature promotes auxin-mediated hypocotyl elongation in., 1998, 95: 7197–7202.

[35] Romano C P, Robson P R H, Smith H, Estelle M, Klee H. Transgene-mediated auxin overproduction in: hypocotyl elongation phenotype and interactions with thehypocotyl elongation andauxin-resistant mutants., 1995, 27: 1071–1083.

[36] Watanabe H, Takahashi K, Saigusa M. Morphological and anatomical effects of abscisic acid (ABA) and fluridone (FLU) on the growth of rice mesocotyls., 2001, 34: 273–275.

[37] Hu Z, Yamauchi T, Yang J, Jikumaru Y, Tsuchida-Mayama T, Ichikawa H, Takamure I, Nagamura Y, Tsutsumi N, Yamaguchi S, Kyozuka J, Nakazono M. Strigolactone and cytokinin act antagonistically in regulating rice mesocotyl elongation in darkness., 2014, 55: 30–41.

[38] Redona E D, Mackill D J. Mapping quantitative trait loci for seeding vigor in rice using RFLPs., 1996, 92: 395–402.

[39] Katsuta-Seki M, Ebana K, Okuno K. QTL analysis for mesocotyl elongation in rice., 1996, 13: 126.

[40] Wu J, Feng F, Lian X, Teng X, Wei H, Yu H, Xie W, Yan M, Fan P, Li Y, Ma X, Liu H, Yu S, Wang G, Zhou F, Luo L, Mei H. Genome-wide association study (GWAS) of mesocotyl elongation based on re-sequencing approach in rice., 2015, 15: 218–227.

[41] Zhao G, Wang J. Effect of gibberellin and uniconazole on mesocotyl elongation of dark-grown maize under different seeding depths., 2008, 11: 423–429.

[42] Masuda Y. Auxin-induced cell elongation and cell wall changes., 1990, 103: 345–370.

[43] Watanabe H, Takahashi K, Saigusa M. Morphological and anatomical effects of abscisic acid (ABA) and fluridone (FLU) on the growth of rice mesocotyls., 2001, 34: 273–275.

[44] Zhang C, Huang Y, Xiao Z, Yang H, Hao Q, Yuan S, Chen H, Chen L, Chen S, Zhou X, Huang W. A GATA transcription factor from soybean () regulates chlorophyll biosynthesis and suppresses growth in the transgenic., 2020, 9: 1036–1041.

[45] Ye H, Du H, Tang N, Li X, Xiong L. Identification and expression profiling analysis offamily genes involved in stress and phytohormone responses in rice., 2009, 71: 291–305.

[46] Nutan K K, Singla-Pareek S L, Pareek A. TheQTL-localized transcription factor OsGATA8 plays an important role in stress tolerance and seed development inand rice., 2019, 71: 684–698.

[47] Zhang L, Li Q, Dong H, He Q, Liang L, Tan C, Han Z, Yao W, Li G, Zhao H, Xie W, Xing Y. Three CCT domain-containing genes were identified to regulate heading date by candidate gene-based association mapping and transformation in rice., 2015, 5: 7663–7673.

[48] Liu D, Zehfroosh N, Hancock B L, Hines K, Fang W, Kilfoil M, Learned-Miller E, Sanguinet K A, Goldner L S, Baskin T I. Imaging cellulose synthase motility during primary cell wall synthesis in the grass., 2017, 7: 15111–15122.

[49] Inouhe M, Inada G, Thomas B R, Nevins D J. Cell wall autolytic activities and distribution of cell wall glucanases inL. seedlings., 2000, 27: 151–156.

[50] Erp H V, Walton J D. Regulation of thegene family by light in the maize mesocotyl., 2009, 229: 885–897.

[51] Zhuang J, Jiang H H, Wang F, Peng R H, Yao Q H, Xiong A S. A rice OsAP23, functioning as an AP2/ERF transcription factor, reduces salt tolerance in transgenic., 2013, 31: 1336–1345.

[52] Hwang S G, Kim D S, Hwang J E, Han A R, Jang C S. Identification of rice genes associated with cosmic-ray response via co-expression gene network analysis., 2014, 541: 82–91.

[53] Li X, Yang D L, Sun L, Li Q, Mao B, He Z. The systemic acquired resistance regulatorattenuates growth by repressing auxin signaling through promoting IAA-amido synthase expression., 2016, 172: 546–558.

Combining QTL-seq and linkage analysis to identify the QTL of mesocotyl elongation in rice (L.)

LIU Chang1, MENG Yun1, LIU Jin-Dong1, WANG Ya-Mei1,*, and Guoyou Ye1,2

1Agricultural Genomics Institute in Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, Guangdong, China;2International Rice Research Institute, Metro Manila DAPO Box 7777, Philippines

Mesocotyl length is an important trait, which affects seedling establishment and early seedling vigor after dry direct seeding. Identifying the loci related to mesocotyl elongation, analyzing the genetic mechanism and selecting varieties with long mesocotyl is the most economic and effective way to promote the popularization of dry direct seeding technology. In this study, an F2population constructed with ‘Changai’ (an extremely long mesocotyl variety) and ‘IR 145’ (an extremely short mesocotyl variety) was used to construct long and short DNA pool, which were re-sequenced at 50×level. Two methods, ΔSNP–index and G–value, were used to identify the quantitative trait loci (QTL) for mesocotyl elongation. A QTL named as, located in the region of 29.56–33.28 Mb on chromosome 3 were detected. After linkage analysis of 184 F2lines with the newly developed KASP markers based on this locus, the region was narrowed down to 28.89–31.03 Mb. Combining the results of gene annotation, linkage analysis, and gene expression analysis,,,,,,,andwere speculated to be candidate genes in this region. These genes were involved in the regulation of plant hormones as well as the mechanism of cell division. This study uncovers a locus related to rice mesocotyl elongation and is helpful for the breeding of long mesocotyl varieties.

mesocotyl; bulked segregant analysis; Δ(SNP-index); linkage analysis; candidate gene

10.3724/SP.J.1006.2021.02082

本研究由中国博士后科学基金项目(2020M68299)和中国农业科学院科技创新工程协同创新任务(CAAS-XTCX2016001)资助。

This study was supported by the China Postdoctoral Science Foundation (2020M68299) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program Cooperation and Innovation Mission of the Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-XTCX2016001).

王雅美, E-mail: wangyamei@caas.cn

E-mail: woshiyonghwa@163.com

2020-11-30;

2021-03-23;

2021-04-07.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210407.0922.004.html