小豆不定芽诱导及再生体系的建立

林建辉 陆玉建 张永磊 李震 朱丽晖 石东里

摘要：以小豆（Vigna angularis）下胚轴为外植体，分析影响小豆不定芽诱导及植株再生的因素，建立高效稳定的小豆离体再生体系。结果表明，小豆不定芽诱导最适培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA;生根最适培养基为1/2MS+0.5 mg/L IBA。

关键词：小豆（Vigna angularis）;胚轴;不定芽;生根;再生

中图分类号：S521         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）24-0236-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.057           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Adventitious buds induction of Vigna angularis and establishment of

the regeneration system

LIN Jian-hui，LU Yu-jian，ZHANG Yong-lei，LI Zhen，ZHU Li-hui，SHI Dong-li

（1.College of Biological and Environmental Engineering，Binzhou University/Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，Binzhou 256603，Shandong，China）

Abstract： In this study， the hypocotyls were used as explants to analyze the factors that affected the adventitious bud induction and plant regeneration of Vigna angularis. An attempt was made to establish an efficient and stable regeneration system of Vigna angularis. The results showed that the optimal medium for the induction of adventitious buds was MS+2.0 mg/L 6-BA， and the optimum medium for rooting was 1/2MS+0.5 mg/L IBA. By analyzing the factors affecting the regeneration of Vigna angularis in vitro.

Key words： Vigna angularis; hypocotyl; adventitious bud; rooting; regeneration

小豆（Vigna angularis）又名赤豆、紅豆、红小豆，为豆科（Leguminosae）豇豆属（Vigna）一年生草本植物，起源于中国，已有2 000多年的栽培历史[1，2]。小豆营养价值丰富，富含多种氨基酸和维生素，蛋白质含量高、脂肪含量低，是理想的高蛋白、低脂肪食品[3]。小豆子粒铁含量丰富，是传统的补血食物[4]。此外，小豆中还含有较多的萜类、异黄酮、皂角甙等生物活性物质，具有较高的药用价值[5]。小豆广泛分布于全国各地，其耐瘠薄、抗干旱、适应性强，是逆境条件下优势杂粮作物[6，7]。不同品种小豆对干旱胁迫的响应存在差异[8]，用PEG处理小豆幼苗，小豆叶片中 MDA和可溶性蛋白含量、SOD活性均发生明显的变化[9]。缺Fe胁迫降低了小豆幼苗叶片的叶绿素含量及光合速率，增加了小豆幼苗根系呼吸速率及Fe3+还原酶活性[10]。利用现有种质资源，选育优质新品种已成为当前小豆研究的重点。随着分子生物学的快速发展，基因工程技术已成为快速高效改良作物遗传性状的重要途径。小豆再生体系建立是进行遗传转化的基础，而关于小豆离体再生和遗传转化研究的报道较少。已有的研究表明，小豆的外植体不同、基因型不同，其离体再生能力和遗传转化条件也不尽相同[11-15]。

目前，小豆离体再生的频率比较低，已成为制约小豆遗传性状快速改良的重要因素。本试验以小豆胚轴为外植体，研究不同植物生长物质对小豆愈伤组织诱导和不定芽分化的影响，建立高效稳定的小豆离体再生体系，从而为下一步小豆遗传转化体系的建立和品质的改良奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

小豆种子由山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心提供。

1.2  方法

1.2.1  培养基的配制

1）愈伤组织诱导和分化培养基。以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA（2.0、3.0和5.0 mg/L）、NAA（0.2和0.5 mg/L）、IBA（0.2和0.5 mg/L）和TDZ（0.05和0.1 mg/L），调节pH到5.8（表1）。所有培养基均添加3%的蔗糖和1%的琼脂。

2）生根培养基。以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.1和0.5 mg/L）和IBA（0.1和0.5 mg/L），调节pH到5.8（表2）。

1.2.2  种子的消毒和种植  选取子粒饱满、种皮完好的小豆种子，自来水冲洗10 min后75%乙醇溶液浸泡30 s，0.1% HgCl2溶液处理10 min，无菌水冲洗5～6次，然后将种子接种到MS培养基中进行培养。小豆的生长条件为16 h光照/8 h黑暗，湿度保持在60%～70%，温度25 ℃，光照度2 000 lx。

1.2.3  愈伤组织的诱导和分化  以生长5 d的小豆下胚轴为材料，切成约2 cm的小段，接种到HD1～HD9培养基中，进行愈伤组织诱导和不定芽的分化培养。2周继代培养1次，30 d统计愈伤组织诱导率，分化出芽的数量和芽分化率。

愈伤组织诱导率=（产生愈伤组织的外植体数/接种数）×100%

不定芽分化率=（产生不定芽的外植体数/接种数）×100%

1.2.4  生根的诱导  当不定芽长度约3～5 cm时，切取生长良好的不定芽，接种于生根培养基R1～R4中进行生根诱导，2周后统计不定芽的生根率和根增殖系数。

生根率=（产生不根的外植体数/接种数）×100%

1.2.5  统计分析  采用EXCEL 2007和SPSS 19.0软件对试验数据进行统计分析及Duncan多重比较。显著性测验，字母相同者差异不显著，字母不同者表示在0.05（小写字母）或0.01（大写字母）水平上差异显著。

2  结果与分析

2.1  植物生长物质对外植体愈伤组织诱导的影响

将小豆下胚轴接种于HD1～HD9培养基中，30 d后统计愈伤组织诱导率。结果表明，上述培养基均可诱导外植体脱分化产生愈伤组织，但培养基中植物生长物质不同，愈伤组织诱导效果也存在明显的差异（图1A）。在HD1～HD4培养基中，小豆产生愈伤组织的量较少且易褐化，诱导率不足50%。愈伤组织诱导效果较好的是HD6～HD8，愈伤组织生长状态较好，诱导率超过75%。其中，诱导效果最好的是HD7，愈伤组织诱导率达到90%，和其他培养基差异极显著（P<0.01）。

2.2  植物生长物质对小豆不定芽诱导的影响

选取生长良好的愈伤组织，接种到HD1～HD9培养基中继续培养，30 d可分化产生明显的不定芽。结果表明，小豆在上述培养基中，植物生长物质明显影响愈伤组织的分化（图1B）。其中效果最差的是HD1，不定芽的分化率只有20%，几乎观察不到明显的不定芽;其次是HD2～HD5，不定芽的分化率不到50%;愈伤组织分化不定芽效果较好的培养基为HD7～HD9，不定芽的分化率达到70%以上，不定芽的数量较多，生长情况较好。其中，HD7培养基中愈伤组织分化产生不定芽的效果最好，不定芽分化率达到90%，不定芽数量多且生长旺盛，和其他培养基差异极显著（P<0.01）。

2.3  植物生长物质对小豆不定芽生根的影响

将小豆不定芽接种到HR1～HR4培养基中，2周后統计不定芽生根率。结果表明，小豆比较容易生根，这4种培养基都可诱导不定芽生根，但植物生长物质不同，生根的效果不同（图1C和图1D）。在HR1和HR2培养基中，不定芽基部产生的根长而匀称;HR3和HR4培养基诱导产生的根短而细小。在HR1培养基中，不定芽生根率大约为60%，数量较少;在HR2培养基中，不定芽生根率最高，达到90%以上，数量较多，根系发达。小豆不定芽在HR3培养基中生根率虽高于HR1培养基，但效果不及HR2培养基，且主根数量较少，根系不发达;在HR4培养基中，不定芽生根率较高，数量较多，接近HR2培养基，但根生长有些异常，许多根向上生长。

2.4  小豆离体再生体系的建立

选取颗粒饱满的小豆种子（图2A），消毒后接种于MS培养基中进行培养。小豆种子萌发较快，4～5 d后即可生长为高度适中小豆幼苗（图2B）。切取长度适宜的下胚轴，接种到HD7培养基中（图2C）。7 d后胚轴顶端细胞开始脱分化产生愈伤组织（图2D）。继续培养14 d后，可观察到有大量的愈伤组织生成，结构致密，呈淡绿色（图2E）。取生长状态较好的愈伤组织，接种到HD7培养基中进行继代培养，愈伤组织急剧增多（图2F）。14 d进行一次继代，部分愈伤组织开始再分化产生不定芽（图2G）。愈伤组织连续继代培养，约30 d后可产生明显的不定芽，但数量较少（图2H）。将分化产生不定芽的愈伤组织继续进行分化培养，愈伤组织体积显著增大，表面产生大量的不定芽，成簇分布，形成丛生芽（图2I），其中结构致密的颗粒状愈伤组织比较适合不定芽的分化培养（图2J）。继续培养至49 d，不定芽逐渐长高，数量不断增多，生长比较旺盛（图2K）。培养60 d后，多数不定芽高度比较适中，可以进行生根诱导（图2L）。不定芽再继续培养至70 d，虽然不定芽仍能继续生长，但部分不定芽开始发黄枯萎，生长状态不佳（图2M）。

不定芽连续继代培养约60 d后，选取长度3～5 cm生长健壮的不定芽，接种到HR2生根培养基中进行生根诱导（图2N）。不定芽生根较快，7 d后基部开始长出不定根，此时数量较少，长度较短。14 d后产生明显的根，继续培养21 d后，根的数量显著增多，根系较为发达，不定芽继续生长，不断产生新枝新叶，进而获得试管苗（图2O和图2P）。

3  讨论

小豆在中国种植历史悠久，具有较高的食用价值和药用价值[4，5]。目前，有关小豆的研究还较少，高效的离体再生体系尚未建立，制约了转基因技术在小豆作物遗传改良中的应用。本研究以小豆胚轴为外植体，分析影响小豆不定芽诱导和植株再生的因素，初步建立起高效稳定的小豆离体再生体系。在适宜的培养条件下，小豆下胚轴诱导14 d后产生明显的愈伤组织;愈伤组织继代培养14 d，愈伤组织继续生长，开始产生芽点;继代培养14 d后产生明显的芽。生根诱导7 d不定芽开始生根，14 d产生明显的根。试验结果表明，影响小豆愈伤组织诱导和分化的最主要因素是6-BA的浓度。当培养基中添加6-BA时，无论是否加入其他植物生长物质，下胚轴均可诱导产生愈伤组织并分化出不定芽。加入NAA、IBA或TDZ，对小豆愈伤组织诱导和不定芽分化不仅没有明显的促进作用，反而还显示出一定程度的抑制作用，抑制效果的强弱和这些成分的浓度有关。在HD7培养基中，外植体产生愈伤组织和不定芽的效果最好，不仅愈伤组织结构致密，生长旺盛，不易褐化，而且再分化产生不定芽数量较多，这与刘红霞[11]的研究结果一致。小豆基因型也是影响小豆离体再生的重要因素，本研究所采用的小豆品种，在最适条件下，愈伤组织诱导率和不定芽分化率均达到90%以上。生根结果表明，以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA和IBA，均可促进不定芽生根。其中HR2培养基最适合生根，不定芽生根率最高，达到90%以上，数量较多，根系发达。对于小豆而言，与NAA相比，一定浓度的IBA更适合不定芽的生根诱导。本研究通过探索小豆离体快繁的最适条件，初步建立起比较高效稳定的小豆离体再生体系，从而为下一步小豆遗传转化体系的建立和生物性状的改良奠定基础。

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