基于肿瘤免疫微环境的弥漫大B细胞淋巴瘤预后分析*

黄玉洁，黄鑫，郭宝平，柯晴，谭晓虹，岑洪

530021 南宁，广西医科大学附属肿瘤医院 淋巴血液肿瘤科

弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型，具有较高的临床和生物学异质性。肿瘤细胞所处的肿瘤微环境(the tumor microenvironment，TME)由肿瘤细胞、多种间质细胞(如免疫细胞)及细胞外基质等组成，在调节肿瘤的发病、进展和转移中起着至关重要的作用，对治疗效果也有深远的影响。一般认为DLBCL在肿瘤组织中可见弥漫性淋巴瘤细胞浸润，正常的免疫细胞成分较少，属于免疫冷肿瘤。免疫细胞在DLBCL发育过程中的作用是复杂的，涉及肿瘤细胞、适应性和天然免疫细胞、可溶性介质及TME中的结构成分之间的相互作用。然而，随着研究不断深入，越来越多的证据表明，DLBCL肿瘤细胞与各种免疫细胞的交互作用对疾病的发展至关重要，这也增加了DLBCL亚型的复杂性。人们逐渐认识到，淋巴瘤细胞与免疫微环境之间的交互作用被破坏，将会导致淋巴瘤细胞逃避宿主的免疫监视，使病情不断进展[1]。随着基因表达谱芯片检测的普及，生物信息学分析技术的进步，目前已经能够分析淋巴瘤组织中各种免疫细胞的成分及各信号通路的活化情况。本研究拟通过生物信息学技术和数据挖掘的方法探讨DLBCL免疫微环境对预后的影响。

1 资料与方法

1.1 资料来源

所有数据从GEO数据库下载(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，选取已公开发表且基因表达谱和临床生存信息完整的3个DLBCL患者数据集纳入分析，即GSE10846、GSE31312和GSE98588，分别得到233、469和105例DLBCL样本。

1.2 数据处理

用R语言程序(4.0.2版本)进行数据处理，采用GSVA函数包对DLBCL患者基因表达数据进行ssGSEA分析，得到每个DLBCL样本在16条免疫相关信号通路的富集分数(enrichment score, ES)；用xCell(https://xcell.ucsf.edu/)根据每种免疫细胞的标记基因特征来量化每种细胞在肿瘤组织中的丰度，计算出27种人类免疫细胞类型在肿瘤组织中的浸润比例。用“survminer”函数R包批量计算样本在16个免疫相关基因集富集分数和27种免疫细胞的浸润比例的最佳截点,分为高、低两组，采用Kaplan-Meier法对两组患者进行生存分析，绘制生存曲线。比较分析ABC亚型和GCB亚型两组样本中免疫相关信号通路的富集差异和免疫细胞浸润比例的差异。

1.3 统计学分析

本研究的统计学分析使用R软件(版本4.0.2)和相关R包进行。分类数据采用n(%)表示。分类资料的组间比较采用t检验。生存曲线分析采用 Kaplan-Meier，组间比较采用Log-rank检验。以双侧P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 入组患者的临床特征

本组患者来源于3个DLBCL数据集，其临床特征见表1。

2.2 免疫相关信号通路与预后的关系

通过对3个DLBCL数据集的分析发现，GSE98588数据集跟预后相关的免疫信号通路有13条，GSE31312数据集跟预后相关的信号通路有16条，GSE10846数据集跟预后相关的信号通路有9条；三个数据集中跟预后相关的共同通路有以下8条(图1、2)：适应性免疫系统通路、淋巴细胞活化通路、MHC Ⅱ类抗原呈递信号通路、Ⅰ型干扰素信号通路、Ⅱ型干扰素信号通路、Th17细胞分化信号通路、T细胞受体信号通路、细胞黏附信号通路；这些通路富集分数高的患者预后更好，提示这些免疫相关信号通路的活化能激活抗肿瘤免疫应答，改善预后。

表1 入组患者的临床特征

2.3 免疫相关通路在ABC亚型和GCB亚型样本的GSEA分析

分别对3个DLBCL数据集基因表达数据进行GSEA富集分析，观察在3个数据集中均有预后意义的8条免疫相关信号通路在ABC、GCB亚型中的富集情况，发现GSE98588富集到有差异(P<0.05)的通路有2条，GSE31312富集到有差异(P<0.05)的通路有3条，GSE10846富集到有差异(P<0.05)的通路有2条(图3)；3个数据集富集分析结果显示，I型干扰素信号通路均在GCB亚型中显著富集(P<0.05)，该通路涉及细胞毒性T淋巴细胞的活化和杀伤，提示GCB亚型比ABC亚型有更强的抗肿瘤细胞免疫应答。

图1 免疫信号通路的富集程度与DLBCL患者预后的关系

图2 GSE10846、GSE98588、GSE31312数据集中与预后相关的通路韦恩图

2.4 肿瘤组织中免疫细胞亚群与预后的关系

通过对3个DLBCL数据集的分析发现，GSE98588数据集中与预后相关的免疫细胞亚群有16个，GSE31312数据集跟预后相关的免疫细胞亚群有19个，GSE10846数据集跟预后相关的免疫细胞亚群有15个；3个数据集中跟预后相关的相同免疫细胞亚群有10个(图4、5):CD4+T淋巴细胞、CD4+效应记忆T细胞、CD4+记忆T细胞、CD8+T淋巴细胞、Th1细胞、活化树突状细胞浸润程度高者预后较好；嗜酸性粒细胞、M2型巨噬细胞、中性粒细胞、Th2细胞浸润程度高者则预后不良。

图3 免疫相关信号通路在ABC-DLBCL和GCB-DLBCL的GSEA分析

图4 免疫细胞浸润程度与DLBCL患者预后的关系

图5 GSE10846、GSE98588、GSE31312数据集中与预后相关的免疫细胞的韦恩图

2.5 比较ABC亚型和GCB亚型DLBCL免疫细胞浸润程度的差异

分析在3个数据集中均有预后意义的10个免疫细胞亚群，观察其在ABC、GCB亚型患者中的浸润比例有无差异。结果显示GSE98588数据集有差异(P<0.05)的细胞亚群有 1个，GSE31312数据集有 3个，GSE10846数据集有 4个(表2)。3个数据集免疫细胞浸润程度差异分析结果显示，中性粒细胞在ABC亚型的浸润程度均显著高于GCB亚型(图6)，提示该细胞浸润程度高可能是ABC型DLBCL预后不佳的原因之一。

图6 ABC亚型和GCB亚型中性粒细胞浸润比例的差异分析

3 讨 论

目前临床上常根据淋巴瘤细胞起源、淋巴瘤细胞基因变异分析等进行DCBCL患者的预后评估，这些方法主要考虑的是肿瘤细胞的特征，而忽略了TME中免疫组分(包括细胞和细胞因子)的作用，未考虑免疫系统对癌症发生发展的影响。既往关于DLBCL免疫微环境的研究大都是基于免疫组化技术，分析肿瘤组织中各种细胞成分的比例及其浸润模式，且研究的细胞亚群有限，且研究结论不一致。Kusano等[2]发现CD4+细胞浸润程度低的DLBCL患者总生存率较低，而这些细胞是以CD4+/CD45 RO1表型为特征的记忆T细胞。进一步的研究发现，B细胞淋巴瘤中激活的记忆CD4+T细胞浸润面积的增加与细胞增殖率的降低相关。另一项研究则表明DLBCL的微环境中高水平的PD-1和FoxP3+细胞群以及CD4+T细胞总数与临床结果的改善相关[3]。有研究发现肿瘤相关巨噬细胞(TAM，M2细胞)是DLBCL的预后不良因素[4-5]，但另一些研究未能得出同样的结论[6]。还有研究发现外周血中性粒细胞与淋巴细胞比例增高是DLBCL预后不良因素[7-8]，而成熟的DC细胞在淋巴瘤组织中的比例增高是DLBCL预后良好的因素[9-10]。

近几年，免疫检查点抑制剂在肿瘤临床治疗中取得了巨大成功，肿瘤与宿主免疫反应之间存在持续的相互作用并决定肿瘤发展的观点已被广泛接受。肿瘤免疫微环境在肿瘤预后评估和治疗中的重要性成为目前关注的重点。但肿瘤免疫微环境非常复杂，涉及的免疫细胞种类繁多，还受到微环境中各种细胞因子的影响。仅研究单一细胞或单一细胞因子难以观察到肿瘤免疫微环境的全貌。随着基因表达谱芯片检测的普及与生物信息学分析技术的进步，目前人们已经能够分析淋巴瘤组织中各种免疫细胞的成分及各信号通路的活化情况。本研究分析了影响DLBCL发展的免疫决定因素，包括关键的免疫细胞类型和细胞免疫相关的信号通路，评估其预后价值。研究发现，多种免疫细胞亚群和多条免疫相关信号通路均与预后相关，三个数据集中跟预后都相关的通路有适应性免疫系统通路、淋巴细胞活化通路、MHC II类抗原呈递信号通路、I型干扰素信号通路、II型干扰素信号通路、Th17细胞分化信号通路、T细胞受体信号通路、细胞黏附信号通路，这些通路都跟抗原递呈、免疫细胞的活化和杀伤功能效应相关，通路富集分数高的患者预后更好，提示这些免疫相关信号通路的活化能激活抗肿瘤免疫应答，改善预后。3个数据集跟预后都相关的免疫细胞亚群中，CD4+T淋巴细胞、CD4+效应记忆T细胞、CD4+记忆T细胞、CD8+T淋巴细胞、Th1细胞、活化树突状细胞浸润程度高者预后好，而嗜酸性粒细胞、M2型巨噬细胞、中性粒细胞、Th2细胞浸润程度高者预后不良。

CD4+T细胞(T辅助细胞)包括不同的细胞亚群(Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞等)，它们的预后意义不同。泛癌研究发现在大部分类型的肿瘤中，Th1细胞与预后良好密切相关[11-12]。其他T辅助细胞群(Th2、Th17和Treg细胞)对预后的影响取决于TME、癌症类型和癌症分期[13-15]。本研究发现浸润性CD8+细胞毒性T细胞和CD4+记忆T细胞与生存期的延长相关，这两种细胞的预后意义已在不同肿瘤中得到证明[16]。DC是决定T细胞活化和分化的关键抗原递呈细胞，活化的DC在多种肿瘤中的浸润增加与生存期的延长有关[17-19]，本研究发现活化的DC是预后良好因素。巨噬细胞是组织驻留的分化单核细胞，具有吞噬活性，通常根据其分化状态和功能作用分为M1和M2亚型。M1型巨噬细胞的特征在于其促炎特性，从而促进了抗肿瘤Th1型反应;M2型巨噬细胞具有抗炎性质，并分泌IL-10，转化生长因子β和其他有助于建立耐受性微环境以及促血管生成因子的介质[20]。M2细胞的高度浸润与乳腺癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤等肿瘤的生存期差有关[21-23]。本研究证实M2亚型是DLBCL预后不良因素。中性粒细胞是循环中最丰富的白细胞，具有吞噬和抗菌能力。在涉及近4 000名肿瘤患者的荟萃分析中，证实肿瘤相关的中性粒细胞密度高与较差的生存率相关[24]，原因可能与肿瘤相关的中性粒细胞释放出多种因子，发挥许多重要功能，包括肿瘤细胞外基质重塑，血管生成以及促进肿瘤生长和侵袭有关[25]。

人们越来越认识到肿瘤的免疫特征与预后相关，且能预测治疗反应。目前一些免疫细胞或因子的预测价值不一致可能是由于对这些细胞和因子的了解不够，以及检测的方法未标准化，需要对TME中多种免疫细胞更全面的理解。在不远的将来，患者的免疫特征也会纳入DLBCL的分型中，指导临床实践。

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