基于GC-MS的小青龙汤挥发性成分研究

曲中原，吴 双，邹 翔，朱室儒，李文兰

(哈尔滨商业大学 药学院/抗肿瘤天然药物教育部工程研究中心，哈尔滨 150076)

小青龙汤出自《伤寒论》，由麻黄(先煎)、桂枝、干姜、五味子、细辛、炙甘草、白芍、半夏八味药组成，具有解表散寒，温化水饮的功效，常用于寒哮证[1].目前对于小青龙汤的研究大多限于单味药的化学成分和整方的药效研究上，而对整方的物质基础和配伍效应研究则很少.

现代研究表明小青龙汤中麻黄挥发油有平喘、祛痰、镇咳、抑菌、抗病毒、解热、镇静等多种作用[2-3 ]，桂枝挥发油具有良好的抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用[4-7]；细辛挥发油具有解痉、抗炎、抗真菌、解热镇痛、中枢抑制、催眠镇静、抗过敏反应等药理作用[8-11]；干姜[12]挥发油具有抗炎、解热、镇痛、抑菌作用.五味子挥发油具有镇咳，调节神经中枢，增强机体对非特异性刺激的防御能力等多种作用[13].

在临床上多种药物不同配伍有不同的作用，为探讨挥发性成分在配伍前后的变化和变化成份在复方中的作用，寻找小青龙汤的药效物质基础，本研究采用气相色谱-质谱( GC-MS) 联用技术对小青龙汤、组方药材及各药材阴性对照处方中挥发性成分进行比较分析，为小青龙汤的物质基础与配伍机制研究奠定基础.

1 仪器和材料

1.1 仪器

G1033-60051气-质联用仪(美国安捷伦公司)，挥发油提取器，加热套.

1.2 材料

麻黄 (内蒙古，批号：YPA5C0001)；干姜(产地：云南罗平，批号：1906039)；桂枝(产地：广西，批号：1909001)；五味子(产地：辽宁，批号：16070701)；细辛(产地：辽宁，批号：1810001)；炙甘草 (内蒙古，批号：150510881)；白芍(产地：安徽，批号：16042101)；半夏(产地：四川江油，批号：D1903002)；以上药材均购买于同仁堂药店，经哈尔滨商业大学药学院中药学教研室曲中原教授鉴定均为优质药材.乙醚为分析纯.

1.3 软件及数据库

Masshunter软件，TCMSP数据库，ChemSpider数据库，NIST08数据库.

2 实验方法

2.1 供试品的制备

小青龙汤挥发油制备：《伤寒论》记载该方为麻黄、芍药、干姜、甘草、细辛、桂枝各三两，五味子、半夏各半升.以水一斗，先煮麻黄，减二升，去上沫，内诸药，煮取三升[1].根据古今度量衡换算，东汉一两为15.625 g，一升为200 mL，一斗为今2 000 mL，故麻黄、芍药、干姜、甘草、细辛、桂枝各约46.9 g，五味子半升约38 g，半夏半升约42 g.本研究参考古法，砂锅中加入2 000 mL水，放入麻黄，待砂锅中余水1 600 mL，除去浮沫，放入剩余药材，文火慢煎，煎至砂锅中剩余600 mL水煎液[14-15].取水煎液，置挥发油提取器中，按《中国药典》 2020年版一部挥发油测定甲法操作，得到挥发油，用乙醚萃取出并定容至0.5 mL.

麻黄、桂枝、细辛、干姜、五味子单味药挥发油制备：取药材46.9 g，放入挥发油提取器中，按《中国药典》 2020年版一部挥发油测定甲法操作，得挥发油，用乙醚萃取出并定容至0.5 mL.

单味药阴性对照挥发油制备：按照小青龙汤中药材配比和提取方法制备相应阴性对照挥发油.

2.2 色谱条件

色谱柱HP-5石英毛细管(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，载气为氦气(质量分数>99.999%)，进样口温度200 ℃，流速:1.0 mL·min-1; 柱压100 kPa；分流比20∶1，进样量1 μL；升温程序为柱温60 ℃，保持5 min，然后以 3 ℃·min-1的速率升到200 ℃，保留5 min.

2.3 质谱条件

离子源 EI，电子能量70 eV，质量扫描范围(m/z)：40～500，离子源温度230 ℃，电离电压1 435 V.

3 结果与分析

分别将11个供试品按照上述测试条件进行GC-MS分析，得到样品挥发油的总离子流图，见图1.将所得数据用Masshunter软件进行分析并与NIST08数据库进行比对确定化合物，采用峰面积归一法计算相对百分含量，结果见表1.

图1 小青龙汤、单味药材、阴性对照样品中挥发油总离子流图Figure 1 Total ion flow diagram of volatile oil in Xiaoqinglong decoction, single herb and negative control (A)Xiaoqinglong decoction; (B)Ephedrae Herba; (C)Cinnamomi Ramulus; (D)Asari Radix et Rhizoma; (E)Zingiberis Rhizoma; (F)Schisandrae Chinensis Fructus; (G)Ephedrae Herba negative control sample; (H)Cinnamomi Ramulus negative control sample; (I)Asari Radix et Rhizoma negative control sample;(J)Zingiberis Rhizoma negative control sample; (K)Schisandrae Chinensis Fructus negative control sample

表1 小青龙汤、麻黄、桂枝、细辛、干姜、五味子及各阴性对照样品挥发油的化学成分及相对百分含量

续表1

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4 讨 论

本研究首次利用GC-MS技术对小青龙汤全方和麻黄、桂枝、细辛、干姜、五味子单味药及相应阴性对照的挥发油化学成分进行比较分析.对复方与单味药的挥发油比较分析发现在种类上都发生了一定的变化，特别是复方新增了4-蒈烯、α-衣兰烯、环烯、1,4-钙二烯、(-)-吉马烯、α-古芸烯.与各单味药阴性对照品进行对比分析发现1,4-钙二烯只存在于小青龙汤、干姜阴性对照和五味子阴性对照样品中；(-)-吉马烯存在于小青龙汤、麻黄阴性对照品、桂枝阴性对照品和干姜阴性对照品中；α-古芸烯存在于小青龙汤、五味子阴性对照品中；Bicyclo[4.4.0]dec-1-ene,2-isopropy-5-methyl-9-methylene-存在于小青龙汤、麻黄阴性对照品和桂枝阴性对照品种中；α-衣兰烯存在于小青龙汤和桂枝阴性对照品中；环烯存在于小青龙汤、桂枝阴性对照品、细辛阴性对照品和干姜阴性对照品中.由此可以推测1,4-钙二烯是由麻黄、桂枝和细辛中的成分变化得到，(-)-吉马烯是由细辛和五味子中化合物变化得到，α-古芸烯是由麻黄、桂枝、干姜和细辛中的成分变化而来，Bicyclo[4.4.0]dec-1-ene,2-isopropy-5-methyl-9- ethylene-是由干姜、细辛和五味子中成分变化得到，α-衣兰烯是由麻黄、细辛、干姜、五味子中成分变化得到，环烯是由麻黄和五味子中成分变化得到.此外，单味药材中存在的个别挥发性成分未在复方中检测到，例如麻黄中的萘、乙酸香叶酯、β-紫罗兰香酮、十二烷酸等15个成分；桂枝中的苯乙醇、3-苯丙醇、肉桂醇等13个成分；细辛中的4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、马兜铃烯、异长叶烯等9个成分；干姜中的甲基庚烯酮、β-香茅醇、δ-榄香烯等12个成分；五味子中的α-松油烯、2-蒈烯、α-Santalene等22个成分.这提示复方中挥发油成分并不是单味药挥发油成分物理加和.单味药中的挥发性成分在复方中未被检出推测可能是成分之间发生了一定的化学变化，生成新的化合物.由于在复方的煎煮中，麻黄需先煎并除去浮沫，所以麻黄的成分在单味药和复方中存在一定的变化，不能确定是挥发油成分的化学变化还是在先煎和除沫过程造成的损失.

对小青龙汤复方和单味药阴性对照品挥发性成分相对含量进行比较，发现甲基丁香酚是细辛、干姜、五味子的共有成分，姜烯是干姜中的挥发性成分，复方中的相对百分含量分别为9.98%和9.86%.当测定在桂枝阴性对照品时，由于桂枝中不含有此成分，推测甲基丁香酚或姜烯的相对百分含量应该升高，但测定结果为降低，分别为8.23%和5.5%.推测桂枝挥发油成分能促进该成分的溶出.肉桂醛是桂枝中挥发性成分，在复方中的相对百分含量为7.61%，在干姜的阴性对照品中为14.54%，推测在复方中干姜挥发油成分抑制了肉桂醛的溶出.以上结果提示中药复方挥发油成分之间会相互影响溶出.

本文研究表明中药配伍对药材的化学成分及含量均有一定的影响.中药复方中挥发性成分及含量不是单味药成分的简单物理加和，存在着成分之间的转化及溶出度的变化.本研究为进一步阐明小青龙汤的配伍原理，阐明挥发性药效物质基础的组成提供了一定的科学依据.