非编码RNA在胆管癌中的研究进展

黄子越，陈旺明，康鹏程，崔云甫，徐艺

哈尔滨医科大学附属第二医院胆胰外科，黑龙江 哈尔滨 150086

作为最常见的原发性胆道恶性肿瘤，胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA)根据其发生部位分为肝内胆管癌和肝外胆管癌[1]。CCA发病率占所有胃肠道肿瘤的3%，且在过去的30年里，CCA的总体发病率有所上升，但确诊后存活5年的病人的百分比没有增加，仍然保持在10%[2]。目前CCA的病因仍不明确，且起病隐匿，恶性程度高，缺乏敏感性和特异性高的肿瘤标志物用于早期诊断。最常用的肿瘤标志物CA19-9诊断敏感性和特异性较低(敏感性62%，特异性63%)[2]，还可能受到胆汁淤积症、细菌性胆管炎、胰腺炎以及其他恶性肿瘤的影响。根治性手术治疗是目前CCA最有效的治疗方法，但手术切除率低且预后差，术后5年总生存率为20%～40%[3]，且复发率高[4]。CCA化学治疗与放射治疗效果不明确，一线化疗方案吉西他滨联合顺铂化疗方案，平均生存期也不足12个月[5]。因此，对于CCA的病理生理过程的研究成了必须克服的难题。

人类基因组计划研究表明，在人类30亿碱基对中，仅有不到2%的碱基序列参与编码蛋白质，其余98%的碱基序列均不参与编码蛋白质，甚至一度被认为是无用序列[6]。随着芯片和高通量测序技术的进步，人们对非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)的生物学功能的研究也逐渐深入，将为其在作为新型肿瘤标志物和潜在的分子靶向药物作用位点提供充足的证据。ncRNA是一类由基因组转录却不参与编码蛋白质的序列，可分为微小RNA(microRNA， miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA， lncRNA)、环状RNA(circular RNA， circRNA)、Piwi相互作用RNA(Piwi interacting RNA， piRNA)等。

一、miRNA与CCA

作为一类由RNA聚合酶Ⅱ转录而成的大小为19～25个核苷酸且无编码蛋白能力的RNA分子[7]，miRNA主要在转录后水平上通过碱基序列的互补配对降解mRNA或者抑制蛋白质的翻译，参与细胞的生长、分化、衰老、凋亡、自噬、迁移、侵袭等过程[8]。miRNA在动物生长发育及基因调控中的作用使人们对miRNA作为新的肿瘤标志物或者分子靶点产生了兴趣。既往研究发现，部分miRNA在多种肿瘤(肺癌、乳腺癌、胆管癌、结肠癌、前列腺癌等)的表达水平有不同程度的上调或者下调。Meng等[9]对CCA肿瘤组织和对应正常组织的实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction， qRT-PCR)定量检测结果显示miR-320、miR-200b、miR-21、miR-23a、miR-141、miR-27a和miR-34a在恶性胆管上皮细胞与正常胆管上皮细胞中的表达有显著差异，其中miR-200b、miR-21、miR-141在CCA细胞中异常高表达，外源性沉默miR-200b和miR-21后可增加CCA细胞对吉西他滨的敏感性，沉默miR-141后会抑制CCA细胞的增殖。

1.miR-21 通过qRT-PCR定量检测和CCA临床病例分析，CCA中miR-21呈异常高表达，进一步的研究证明15-羟基前列腺素脱氢酶(15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase， 15-PGDH)是CCA细胞中miR-21的直接靶标，15-PGDH 是将前列腺素E2(prostaglandin E2， PGE2)转化为生物学上无活性的代谢产物的关键酶。同时，环氧合酶2(cycloxygenase2， COX2)的过表达和PGE2的积累可通过增强miR-21启动子的活性上调miR-21的表达水平。miR-21通过抑制15-PGDH的表达导致PGE2积聚，增强的PGE2信号进一步刺激miR-21转录，提高细胞miR-21水平，这些信号级联形成一个前馈环路，驱动CCA的发生和肿瘤的进展[10]。因此，阻断COX2/PGE2信号转导联合靶向miR-21有希望成为治疗CCA的有效方法。另有研究[11]证实miR-21可通过直接抑制靶基因同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog， PTEN)和14号蛋白质酪氨酸磷酸酶非受体(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 14， PTPN14)的表达来促进细胞增殖和肿瘤生长，且miR-21的高表达与不良的临床病理特征显著相关，miR-21的表达水平的高低也可以预测总体生存期的长短，因此miR-21可作为CCA预后不良的独立预测因子。

2.miR-29b 有研究[12]通过qRT-PCR定量检测，结果显示miR-29b在CCA中呈异常下调表达，低表达的miR-29b会抑制CCA细胞凋亡的发生，进一步的研究证实抗凋亡蛋白髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1， Mcl-1)的表达受到miR-29b的调控，因此可以通过上调miR-29b表达从而降低细胞Mcl-1水平达到促凋亡的效果。

3.miR-26a Zhang等[13]研究证实miR-26a在CCA肿瘤组织中异常高表达，过表达的miR-26a通过抑制糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase， GSK-3)和随后激活β-链蛋白(β-catenin)促进CCA细胞的增殖和体外集落形成。Wang等[14]对66例CCA病人术前、术后和66例正常健康者血清进行检测发现，CCA病人术前血清中miR-26a的表达水平明显高于正常健康者及CCA病人术后血清内miR-26a的表达，术后接受化疗的病人血清内miR-26a的表达水平已经接近正常健康者，而术后复发的病人血清内miR-26a则呈明显的上升，表明血清miR-26a有希望作为有效的生物标志物，用于CCA的早期检测。

4.miR-370 An等[15]研究表明与正常组织相比，CCA组织中miR-370表达下调，而白细胞介素(IL)-6表达上调，且多变量分析结果显示miR-370与IL-6的表达水平呈负相关。Meng 等[16]通过进一步研究证实 IL-6 表达上调会通过甲基化依赖性调节导致miR-370的表达下调，随后的研究发现IL-6 的表达上调可使 let-7a 表达增加，从而降低信号转导及转录激活因子(STAT)3的磷酸化速度，促进肿瘤细胞的增殖并发挥抗凋亡作用[17]。

5.miR-200家族 Peng等[18]发现4个miR-200家族成员(miR-200a/b/c/429)在CCA肿瘤组织和细胞中呈显著下调表达，进一步研究证实miR-200b/c通过直接靶向Rho-激酶2(Rho-kinase 2)促进肿瘤细胞侵袭和转移，还通过直接靶向SUZ12来调节肿瘤的发生发展，随后上调miR-200b/c的表达，肿瘤细胞对氟尿嘧啶的敏感性提高。相似的研究[19]通过上调CCA细胞中 miR-29b、miR-205、miR-221的表达水平可增强肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性。另有研究[20]证实miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p和miR-200c-3p对CCA的诊断能力均高于CA19-9，其中miR-200c-3p诊断能力最强，miR-200a/c-3p的水平与肿瘤进展密切相关。

6.胆汁中miRNA 胆汁是CCA生物标志物的潜在来源，近年来胆汁中的细胞外miRNA表达差异与CCA的关系也有很多研究。有研究[21]通过106例胆道梗阻病人的胆汁标本(58例良性胆道病人，48例CCA病人)对比，得出CCA病人胆汁中miR-30d-5p和miR-92a-3p的表达明显上调，进一步研究表明miR-30d-5p和miR-92a-3p的靶基因可能参与Hippo、Wnt、p53、MAPK及EGFR等信号通路。受试者工作曲线分析显示，胆汁来源的细胞外miR-30d-5p和miR-92a-3p可作为鉴别CCA的生物标志物，其中miR-30d-5p诊断效果最好，敏感性为81.1%，特异性为60.5%。另有研究[22]表明胆汁中携带miR-195的细胞外囊泡能够通过抑制CCA细胞的生长和结缔组织增生程度而导致肿瘤缩小，延长生存时间，达到治疗效果。

既往研究[7-8]显示，miRNA可通过控制肿瘤细胞的生物学行为或靶向调控基因参与肿瘤的发生发展，因此继续深入研究miRNA在CCA中的作用机制，将有助于了解CCA的病理生理机制，从而为CCA的诊断和靶向治疗提供新的方向。

二、lncRNA与CCA

作为一类长度超过200 nt且无编码蛋白能力的RNA分子[23]，lncRNA可充当细胞信号通路的调控靶点参与多种基因的表达修饰[24]。既往研究表明lncRNA的表达失调控可通过诱导下游分子靶点的差异表达与蛋白结构异常参与包括乳腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌等在内的多种恶性肿瘤的发生发展[25]。对于CCA中lncRNA的作用机制的研究将有助于为CCA的早期诊断提供有效的肿瘤标志物或寻找潜在的分子靶向治疗位点。越来越多的研究证实，许多异常表达的lncRNA不同程度地影响着肿瘤细胞的增殖和侵袭转移能力，以及凋亡的发生和化疗敏感性。

1.lncRNA CPS1-IT1 Ma等[26]研究证实在CCA组织和肿瘤细胞中lncRNA CPS1-IT1呈异常高表达，且 lncRNA CPS1-IT1表达水平与组织分化程度、肿瘤大小、淋巴结侵犯密切相关，高表达 lncRNA CPS1-IT1病人的整体生存情况更差，因此 lncRNA CPS1-IT1的表达水平可作为CCA整体生存时间的独立判断因素。

2.lncRNA CCAT1 Jiang等[27]通过临床病例发现lncRNA CCAT1高表达的CCA病人组较低表达的病人组整体生存时间明显缩短，进一步通过lncRNA CCAT1表达水平与临床病例的多因素变量分析，CCA病人组织或血清内lncRNA CCAT1的表达水平可用于CCA的诊断且效果优于CA19-9(敏感性为81.8%，特异性为74.5%)。Zhang等[28]通过120例CCA组织芯片发现lncRNA CCAT1在肿瘤组织中表达显著上调，且lncRNA CCAT1的表达水平与TNM分期、淋巴结转移密切相关，利用siRNA外源性沉默lncRNA CCAT1基因后肿瘤细胞的侵袭和转移能力受到明显抑制，随后生物信息学分析和荧光素酶实验显示lncRNA CCAT1可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA， ceRNA)直接结合miR-152，阻断miR-152与下游靶基因的结合，从而抑制CCA细胞的转移和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transtition， EMT)过程。

3.lncRNA-H19 Xu等[29]研究表明CCA病人肿瘤组织中lncRNA-H19高表达并通过影响EMT过程促进细胞转移和侵袭，且lncRNA-H19表达水平与CCA的预后呈负相关，同时lncRNA-H19高表达者的5年生存率为0，而低表达者5年生存率为28%，并且高表达者的中位生存时间为29个月，而低表达者的中位生存时间可达42个月。也有研究[30]表明lncRNA H19和HULC可分别通过吸附let-7a/let-7b和miR-372/miR-373从而影响癌细胞的增殖和转移。

4.lncRNA NEAT1 Zhang[31]等对33例CCA病人肿瘤组织与癌旁正常组织比较，发现肿瘤组织中lncRNA NEAT1异常高表达，通过转染干扰小RNA(small interfering RNA， siRNA)外源性沉默lncRNA NEAT1后，癌细胞中E-钙黏着蛋白含量降低，细胞黏附能力下降，从而导致癌细胞的侵袭和转移能力下降。

5.lncRNA CBR3-AS1 研究[32]通过qRT-PCR定量检测结果显示癌组织中 lncRNA CBR3-AS1呈异常表达上调，且 lncRNA CBR3-AS1的表达水平与CCA的淋巴转移、TNM分期密切相关，且lncRNA CBR3-AS1高表达组病人整体生存时间更短，通过转染外源性沉默lncRNA CBR3-AS1后可显著抑制肿瘤细胞的增殖。

6.lncRNA PVT1 研究[33]报道lncRNA PVT1在CCA肿瘤组织中呈异常上调表达，且lncRNA PVT1表达水平与CCA病人肿瘤大小、组织分化程度和淋巴结浸润密切相关。

7.lncRNA MALAT1 研究[34]通过qRT-PCR定量检测结果显示lncRNA MALAT1在CCA中呈异常表达上调，外源性沉默该基因后肿瘤细胞的增殖和侵袭能力均受到抑制，进一步的研究显示lncRNA MALAT1是通过激活PI3K/Akt信号通路促进CCA细胞的增殖、转移和EMT进程。另有研究[35]报道lncRNA MALAT1也可通过内源性竞争机制与miR-204结合，导致miR-204失去对下游靶基因CXCR4的调控，从而促进CCA细胞的增殖和转移。

越来越多的研究表明lncRNA在大部分人体恶性肿瘤中异常表达，参与包括增殖、抗凋亡、侵袭、迁移、耐药等多种肿瘤恶性生物学行为，同时展现出各种复杂的调控机制；且lncRNA的异常表达水平与肿瘤的临床特征及病人预后密切相关。但现在的研究更多的是体内细胞实验，对于体外动物实验的开展仍较少，且更深层面的lncRNA调控机制仍待探索，分子靶向药物的作用位点仍不清晰，相信随着研究的不断深入，一定会逐渐揭示lncRNA的作用机制，为肿瘤的早期诊断和治疗提供充足的证据。

三、circRNA与CCA

circRNA于1976年在病毒中被首次发现[36]，一度被认为是剪切错误的结果。circRNA在生物体内丰富表达，但进化上却有高度保守性[37]，由于circRNA是没有3′和5′末端的共价闭合的连续环，这种特殊的结构使circRNA更稳定，更能抵抗核酸外切酶的降解，因此使得circRNA具有巨大的生物学潜能。既往研究[8，37]表明circRNA主要充当miRNA海绵，发挥竞争性内源RNA作用，或调控转录和编码蛋白质。

Xu等[38]通过qRT-PCR定量检测结果显示circ_0001649在CCA组织中呈显著下调表达，并分析了circ_0001649的表达水平与临床病理特征的相关性，Fisher精确检验表明低表达的circ_0001649与CCA中肿瘤较大和分化程度低密切相关。转染circ_0001649过表达载体后癌细胞的侵袭和转移受到明显抑制，而外源性沉默circ_0001649后则产生了相反的结果，因此circ_0001649可作为一个抑癌基因成为CCA的相关治疗靶点。另有研究[39]通过qRT-PCR定量检测结果显示circ_0005230在CCA组织和细胞内呈上调表达状态，circ_0005230的表达水平与临床病理分期密切相关过表达的circ_0005230通过海绵化miR-1238和miR-1299促进CCA细胞的生长和转移，外源性沉默该基因后，正常胆管上皮细胞的生长和凋亡无影响，而CCA肿瘤细胞的增殖能力被抑制，细胞周期停滞在G0/G1期，肿瘤细胞凋亡增加。还有研究[40]证实circ_000284在CCA组织内、血浆中呈异常上调表达，进一步研究表明circ_000284通过与miR-637竞争性结合，导致LY6E上调，从而刺激CCA的增殖和转移，同时外泌体介导的circ_000284可刺激邻近正常细胞的恶性生物学行为，从而促进CCA的发生发展。Lu等[41]通过92例CCA病人的肿瘤组织和癌旁正常组织发现肿瘤组织中circ SMARCA5的表达下调，且circ SMARCA5高表达与肿瘤分期呈负相关，进一步通过Cox回归分析显示，高表达的circ SMARCA5可延长总生存期，同时会提高肿瘤细胞对吉西他滨和顺铂的化疗敏感性。还有研究[42]证实circRNA Cdr1as在CCA肿瘤组织中表达上调，circRNA Cdr1as表达水平与CCA的TNM分期和术后复发密切相关，此外，通过多变量分析证实circRNA Cdr1as的表达水平与CCA病人的总生存期呈负相关，因此circRNA Cdr1as可作为CCA病人预后的独立判断因素。Xu等[43]研究表明在CCA细胞中，circ-CCAC1通过海绵化miR-514a-5p上调转录因子YY1(YIN-YANG 1 transcription factor)从而促进细胞进程，细胞中circ-CCAC1的上调促进了CCA细胞的增殖和转移，因此其有可能作为新的肿瘤标志物和生物治疗靶点。

目前的研究表明circRNA主要起miRNA海绵作用，解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，但是对于circRNA和miRNA相互作用的详细机制仍不清楚，同时未明确阐述circRNA与CCA存在直接关系，且目前仍缺乏足够样本量的动物实验和临床研究证实circRNA在治疗中的作用，相信通过加强这方面的研究，circRNA就有可能成为新型有效的肿瘤标志物和分子治疗的靶点。

四、piRNA与CCA

作为一类主要存在与哺乳动物生殖细胞和干细胞中的长度约为30 nt的小RNA分子，piRNA通过与PIWI蛋白家族成员结合形成PIWI复合物影响转座子沉默、精子发生、基因组重排、表观遗传调控、蛋白质调控和生殖干细胞维护[44]。研究表明，piRNAs可以组织特异性的方式在多种人类组织中表达，并在转录或转录后水平调节关键信号通路。此外，越来越多的研究表明，在各种癌症中异常表达的piRNA和PIWI蛋白有可能作为肿瘤诊断和治疗的新的生物标志物和治疗靶点。Gu等[45]研究显示：与健康人相比，CCA病人血清中有694个piRNAs表达上调，36个piRNAs表达下调，对CCA病人术前、术后1周血清内piRNA及健康体检者血清内piRNA检测，发现CCA病人术后1周血清中piR-10506469和piR-14090389较术前显著降低。此外，通过临床病例和多因素变量分析，piR-20548188的表达水平与CCA病人的TNM分期密切相关。综上所述，在CCA血浆中差异表达的多个外泌体piRNAs可能是诊断CCA潜在生物标志物。亦有研究发现部分PIWI蛋白在肿瘤中特异性表达，参与肿瘤的发生发展。有研究[46]通过检测41例肝门部胆管癌(hilar cholangiocarcinima， HCCA)组织和10例正常胆管组织中PIWIL2的表达发现PIWIL2在HCCA组织中呈显著高表达，进一步临床病理特征分析表明PIWIL2的表达水平与肿瘤大小、病理类型及淋巴转移无关，而与TNM分期及肿瘤分化程度密切相关，且生存曲线结果显示PIWIL2高表达病人组的整体生存时间较低表达组更短。目前对于piRNA与CCA的研究较少，仅仅报道了piRNA在CCA病人血清中的表达差异，且piRNA参与CCA进程的调控机制仍不清晰，仍需进一步的探索与研究，为肿瘤的综合治疗提供充足的理论依据。

五、小结与展望

目前的研究表明，ncRNA通过影响CCA肿瘤细胞的生物学行为或靶向调控基因从而影响CCA的发生发展。但由于ncRNA数量庞大，种类繁多，且目前对于ncRNA准确的表达位点、作用方式以及靶基因的研究仍不明确，因此继续深入研究在CCA的发生发展中发挥重要的ncRNA， 分析其与疾病发生之间的因果关系和作用机制，将为CCA的诊断和治疗提供有效的思路。