宫颈上皮内瘤变组织P16、Ki67表达及临床意义

游娟 旦措毛 湛秀莲 冯爽

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，具有高发病率与高病死率等特征，且近些年随着生活方式改变，发病群体逐渐偏向年轻化[1]。宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN） 与 宫 颈 癌 密 切 相关，亦属于一种子宫颈病变，其按严重程度可分为CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级，其中Ⅰ级CIN大多数可自行消退，而Ⅱ、Ⅲ级CIN则具有较大癌变可能[2]。目前临床针对CIN的主要治疗方式为手术治疗，其中以宫颈高频电波刀电圈切除术（loop electrosurgical excision procedure，LEEP）最为常见，其具有操作简便、微创等优势[3]。但相关研究显示，手术治疗虽安全有效，但手术引起的并发症仍是一大难题[4]。因此对CIN患者进行精准分级对治疗方案的制定有重要意义。近些年，组织标本活检逐渐成为进行CIN分级的重要方式，其中主要以P16、Ki67为主[5]。鉴于此，本研究分析CIN组织中P16、Ki67的表达，分析其与CIN分级的相关性，旨在为临床治疗方案制定提供参考依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月-2020年1月本院病理科手术切除100例CIN患者的组织标本。纳入标准：患者均经第二代杂交捕获试验（hybrid Capture Ⅱ，HC-2）和术后病理检查确诊为CIN。排除标准：（1）合并盆腔炎、尖锐湿疣或妇科肿瘤；（2）合并中枢神经系统病变；（3）合并血液性疾病；（4）合并免疫功能障碍。患者年龄32～71岁，平均（48.73±2.59）岁；CIN分级：CINⅠ级65例，Ⅱ级35例。本研究经医院伦理委员会审核批准后，患者及其家属均知情且自愿签署知情同意书。

1.2 方法

组织样本P16、Ki67的表达检测。将所有标本放置进10%甲醛溶液中行固定处理，石蜡包埋后，作4 μm连续切片处理，而后行HE染色与免疫组化SP法染色，采用枸橘酸钠进行高压抗原修复，DAB溶液下行显色处理。采用PBS溶液作为阴性对照，取已知P16、Ki67高表达的宫颈癌组织作为阳性对照。其中P16、Ki67鼠抗人单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色溶液均购自福州迈新供公司。

1.3 观察指标及评价标准

（1）比较P16、Ki67在 CIN P16 Ⅰ、Ⅱ 级中的表达情况。P16判定标准：胞核着色或胞核与胞浆同时着色判定为阳性，计数阳性细胞百分比，0～10%细胞阳性为阴性（-）；10%～50%细胞阳性为弱阳性（±）；＞50%细胞阳性为阳性（+）。Ki67判定标准：阳性信号位于胞核。阳性细胞仅位于基底或基底旁层为阴性（-）；阳性细胞达上皮下1/3层为弱阳性（±）；阳性细胞达上皮中1/3层为阳性（+）；阳性细胞达上皮上1/3层为强阳性（++）。阳性表达=阳性+强阳性。（2）分析P16和Ki67与CIN分级的相关性。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 24.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，相关性采用Spearman相关系数进行描述，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16、Ki67在各分级CIN病变中活检表达情况

CINⅠ级中P16、Ki67多为阴性与弱阳性表达，分别为69.23%、80.77%；而CINⅡ级中P16、Ki67多为阳性或强阳性表达，均为77.14%；CINⅠ级、Ⅱ级患者P16和Ki67阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1、表2。

表1 P16在各分级CIN病变中活检表达情况[例（%）]

表2 Ki67在各分级CIN病变中活检表达情况[例（%）]

2.2 P16、Ki67表达与CIN病变分级的相关性

Spearman相关分析显示，P16、Ki67表达与宫颈病变程度均呈正相关（r=0.653、0.692，P＜0.05）。

3 讨论

宫颈癌是临床常见恶性肿瘤之一，CIN是发生于宫颈癌早期的一种子宫颈病变，根据异常程度分3级CIN（CINⅠ级、CINⅡ级和CINⅢ级），从CIN自然病史来看，极少数的CINⅠ级患者将发展成浸润性癌，大约23%的CINⅡ级患者将发展成浸润癌或者原位癌，大约15%的CINⅢ级患者可发展成浸润性癌[6]。目前临床对于大多数CINⅠ级患者主要采用保守治疗，而对于CINⅡ级、Ⅲ级主要为宫颈局部治疗，如宫颈消融或LEEP术。有研究显示，CIN各级具有一定自然消退可能性，且目前所采用的LEEP术具有一定的安全风险，术后伴有诸如组织增生、宫颈管缩短等并发症，不利于患者预后[7]。因此对于CIN患者的病理分级准确判定对于治疗方案制定具有重要临床意义。

有研究指出，对于CINⅠ级的分级判断与术后病理学诊断一致性仅为64%，而CINⅡ级与术后病理学诊断的一致性则低于50%，因此寻找一种高效、敏感的CINⅠ级、Ⅱ级判断标志物对于CIN患者治疗方式制定迫在眉睫[8]。细胞分子生物学研究认为，恶性肿瘤发生的本质上是由于细胞周期的调控紊乱，呈现出过度增殖和凋亡不足的状态。近年来，随着对细胞周期调控研究的不断深入，大多数学者认同了肿瘤的发生多与细胞周期调控有关的观点，因而检测影响细胞周期调控的生物标志物，可以预测肿瘤的发生及发展。本研究结果显示，P16在CINⅠ级、Ⅱ级病变中阳性表达率分别为30.77%（20/65）、77.14%（27/35）；Ki67在CINⅠ级、Ⅱ级病变中阳性表达率分别为20.00%（13/65）、77.14%（27/35），差异均有统计学意义（P＜0.05）。CINⅠ级中P16、Ki67多为阴性与弱阳性表达，分别为69.23%、80.77%；而CINⅡ级中P16、Ki67多为阳性或强阳性表达，均为77.14%。CIN患者P16、Ki67表达与CIN分级正相关（r=0.653、0.692，P＜0.05），提示P16、Ki67可作为CIN临床病理分级参考依据。分析其原因可能在于，目前临床对于CIN分级主要采用传统的组织病理学判断，有研究指出医师的自身观念、资历不同可能对CIN分级做出不同判断[9]。P16是一个肿瘤抑制基因，位于9p21，全长8.5 kb，由3个外显子和2个内含子组成，作为一种细胞周期素依赖性激酶（CDKs）抑制物，其可通过抑制CDK活性以达到抑制pRb的磷酸化效果，较低水平磷酸化的pRb可通过与转录因子E2F结合并抑制其活性，使得细胞处于较早期阶段。人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）E7蛋白通过与pRb结合导致其失去活性并释放转录因子E2F，促进细胞繁殖，而细胞繁殖则可使P16呈高表达状态，但因E7蛋白与pRb具有更高亲和力，导致P16失去对于细胞周期的抑制效果从而聚集于细胞中[10-11]。Ki67是细胞增殖的标志物，在细胞周期的G1、S、G2和M期表达，但在G0期不表达，Ki67增殖指数与肿瘤分化、侵袭、转移和预后密切相关，它被广泛用于检测各种恶性肿瘤细胞的增殖和恶性程度。Ki67是一种细胞增殖活性相关抗体，其阳性表达程度可反映细胞增殖活跃度。丁莉利等[12]研究结果显示，P16、Ki67在高度CIN中阳性表达率高于低度CIN，与本研究结果相似，提示P16、Ki67表达与CIN分级密切相关。P16在宫颈鳞状上皮非肿瘤性病变中的阳性率很低，但在CIN中的阳性率较高，尤其是在高级别CIN中，阳性率极高，作为辅助诊断标志物，P16可以有效区分CIN病变。Ki67在宫颈癌的不同CIN中逐渐增加，并且在预测低水平CIN是否可以发展为高水平CIN方面具有很强的预测价值。部分宫颈病变的病理学诊断及鉴别非常困难，绝经后女性的鳞状上皮萎缩及CIN病变，尤其是高度的CIN病变；宫颈腺体的鳞化及化生性增生与CIN病变；严重的宫颈炎可能刺激上皮反应性增生或掩盖高度的CIN，应当引起临床重视。

综上所述，CIN患者P16、Ki67在CINⅠ级、Ⅱ级病变中均有不同程度表达，且P16、Ki67阳性表达与CIN分级呈正相关，可作为CIN临床病理分级参考依据。但由于纳入样本量有限及并未探讨P16、Ki67对于CIN患者预后的影响等因素，导致本研究结果可能不够全面，因此后续研究中应纳入充足样本量并将P16、Ki67对于CIN患者预后的影响纳入研究范围，以获取更准确、全面的研究结论，为临床治疗方案制定及预后判断提供更全面准确的依据。