金钗石斛生物碱对阻塞型睡眠呼吸暂停低通气综合征的影响

何 燕，陈 鹏(.成都市第六人民医院内科，成都 6005；2.成都市第三人民医院呼吸内科，成都 6003)

阻塞型睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hyponea syndrome，OSAS)是一种临床常见的睡眠期疾病，在成年男性中多发，且患病率随年龄递增[1]。OSAS是由于睡眠状态下，上呼吸道塌陷使气道狭窄或者阻塞，导致慢性间接性缺氧，患者突出的临床表现为睡眠伴打鼾、憋醒、白天嗜睡等。此外，OSAS可导致脑供氧量降低，脑细胞神经功能异常，并增加心脑血管疾病的发生风险[2]。OSAS患者普遍存在认知障碍，主要表现为短期记忆力、注意力、执行能力、警觉性差等[3]。金钗石斛生物碱是从传统中药金钗石斛中提取而来，具有抗肿瘤、降血脂、保护神经等药理作用。有研究表明，金钗石斛生物碱可减轻大鼠海马神经元损伤，改善大鼠学习、记忆功能[4]。本研究基于凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease-activating factor-1，Apaf-1)/天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9)通路研究金钗石斛生物碱对OSAS大鼠认知功能和记忆力的改善作用，为金钗石斛碱在OSAS临床治疗中的运用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 5417R高速离心机(德国Eppendorf公司)；Icycler实时荧光逆转录聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)仪(美国Bio-Rad公司)；多导睡眠监护仪(美国Neurotronick公司)，配套使用Polysmith分析软件；BMJ-3包埋机(常州中威电子仪器厂)；BX-70光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；iWorx多通道生理信号记录仪(海玉妍科学仪器有限公司)，配套使用LabScribe数据采集软件；Mini-PROTEAN Tetra电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2试药 质量浓度0.1 g·mL-1水合氯醛(上海羽朵生物科技有限公司)；透明质酸钠凝胶(常州药物研究所有限公司)；金钗石斛生物碱(成都普斯生物科技股份有限公司)；丁苯酞注射液(石家庄石药集团有限公司)；细胞裂解液(北京百奥莱博科技有限公司)；RNA提取试剂盒和反转录试剂盒均购自美国Sigma公司；苏木素伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；蛋白免疫印迹试剂盒(德国PerkinElmer公司)；原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick and labeling，TUNEL)试剂盒(美国罗氏公司)；引物设计委托生工生物工程(上海)股份有限公司；兔Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗和山羊抗兔二抗均购自美国Abcam公司。

1.3动物 3月龄SPF级SD雄性大鼠60只(体质量320～340 g，北京安凯毅博生物技术有限公司)。

2 方法

2.1建模及给药方法 自60只大鼠中随机挑选50只建立OSAS模型，余下10只列入对照组。建模组大鼠使用质量浓度为0.1 g·mL-1的水合氯醛腹腔注射麻醉，模拟大鼠睡眠时的状态：受较弱刺激时无反应，受较强刺激时有反应，此时大鼠脑电出现睡眠期特征(低频率、高幅度)。使用开口器，暴露大鼠口咽腔。将透明质酸钠凝胶注入大鼠舌腭弓、咽腭弓和舌根处，直到大鼠出现呼吸暂停。对照组在相同位置注射等量生理盐水。使用多导睡眠仪观察大鼠呼吸、脑电和血氧饱和度直到大鼠完全清醒。OSAS建模成功的标准如下。呼吸暂停：口鼻气流停止时间长于10 s；低通气：气流强度降低超过50%正常气流强度，并且血氧饱和度降低超过3%，或者伴随轻微觉醒。当呼吸暂停次数和低通气指数(apnea-hypopnea index，AHI)≥5次·h-1，记作大鼠OSAS模型建模成功[5]。将成功建模的大鼠随机分为5组：模型组，金钗石斛生物碱高、中、低剂量组和丁苯酞组。金钗石斛生物碱高、中、低剂量组分别用0.36、0.18和0.09 g·kg-1金钗石斛生物碱灌胃，丁苯酞组用40 mg·kg-1的丁苯酞灌胃，模型组和对照组分别用等体积的生理盐水灌胃。每天1次，连续处理12周。

2.2大鼠认知能力检测 处理后，应用旷场实验分析大鼠的认知能力。使用长、宽、高均为60 cm的正方体敞箱，底部有5 cm正方形方格，将大鼠放置在中央格，令其自由活动，使用图像监视系统观测大鼠探索总里程、中央方格停滞时间。每次实验结束均使用质量浓度为0.85 g·mL-1的乙醇去除大鼠残留的气味。

2.3大鼠记忆力检测 处理后，通过新位置识别实验研究大鼠的记忆力。旷场实验结束1 d后，将大鼠放置于玻璃箱内，将2个相同物体平行置于同一角落，任大鼠自由探索10 min，记录大鼠对该2个物体的探索时间。探索结束后，将大鼠放回饲养笼中。1 h后，将其中的一个物体改变位置，置于箱子中央。再次将大鼠放置在玻璃箱内观察大鼠对2个物体的探索时间。将识别记忆指数作为评价大鼠记忆能力的指标。识别记忆指数=[新位置探索时间/(新位置探索时间+旧位置探索时间)]×100%。每次实验结束均使用质量浓度为0.85 g·mL-1的乙醇去除大鼠残留气味。

2.4大鼠海马角1区组织病变观察 通过HE染色对大鼠海马角1(cornus ammonis 1，CA1)区组织进行病理学观察。取大鼠CA1区组织，使用质量浓度为0.04 g·mL-1的多聚甲醛固定24 h后，使用石蜡包埋，将组织石蜡块切成厚度为4 μm的切片，经过脱蜡复水后，对切片进行HE染色。使用中性树脂封片，在光镜下观察。

2.5大鼠海马角1区神经元凋亡检测 通过TUNEL检测大鼠海马CA1区神经元凋亡情况。海马CA1区组织切片制备方法同上，脱蜡复水后，滴加100 μL蛋白酶K工作液，37 ℃孵育15 min，按照TUNEL试剂盒说明书依次加入封闭液、TdT酶反应液、HRP工作液和DAB显色液后，置于光镜下观察，每组选择5个视野统计TUNEL阳性细胞数和视野中的细胞总数。细胞凋亡指数=阳性细胞数/细胞总数×100%。

2.6大鼠海马组织中Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相对表达量检测 应用RT-qPCR检测大鼠海马组织中Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相对表达量。取大鼠大脑海马区组织研磨成匀浆，使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，并将RNA反转录为cDNA。按照自NCBI基因库中查找到的Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA序列，设计上、下游引物，见表1。设置退火温度为56 ℃，40个循环，以GAPDH为内参，依据2-△△CT计算出Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相对表达量。

表1 引物序列及扩增产物长度Tab.1 Primer sequence and amplification product length

2.7大鼠海马组织中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax 蛋白表达水平检测 应用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测大鼠海马组织中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax 蛋白的相对表达量。取大鼠大脑海马区组织研磨成匀浆，加入细胞裂解液提取脑组织总蛋白，并上样进行SDS-聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳，转膜，使用脱脂牛奶室温孵育封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，使用磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline twen，PBST)洗膜3次后更换二抗，室温孵育2 h后，显色。根据条带灰度值，以GAPDH为内参，分析Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白的相对表达水平。

3 结果

3.1大鼠认知能力检测 48只大鼠建模成功，2只大鼠在建模过程中窒息死亡被剔除。各组大鼠分组情况：对照组10只，模型组和丁苯酞组各9只，金钗石斛生物碱高、中、低剂量组各10只。模型组大鼠探索总里程长于对照组(P<0.05)，丁苯酞组及金钗石斛生物碱高、中、低剂量组均短于模型组(P<0.05)，与丁苯酞组相比，金钗石斛生物碱高剂量组减小(P<0.05)，低剂量组增加(P<0.05)；模型组中央方格停滞时间短于对照组(P<0.05)，丁苯酞组及金钗石斛生物碱高、中、低剂量组均长于模型组(P<0.05)，与丁苯酞组比较，金钗石斛生物碱高剂量组延长(P<0.05)，低剂量组缩短(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠旷场实验结果Tab.2 Results of open field experiment of rats

3.2大鼠记忆力检测 大鼠记忆识别指数模型组低于对照组(P<0.05)，丁苯酞组及金钗石斛生物碱高、中、低剂量组均高于模型组(P<0.05)，与丁苯酞组比较，金钗石斛生物碱高剂量组升高(P<0.05)，低剂量组降低(P<0.05)，见表3。

表3 大鼠新位置识别实验结果Tab.3 Experimental results of new position recognition in rats

3.3大鼠组织病理学观察 对照组海马CA1结构清晰，神经细胞数量较多，排列整齐，神经细胞形态正常，核仁清晰。模型组神经细胞数量较少，排列紊乱，神经元出现明显肿胀，核仁消失并出现坏死细胞。丁苯酞组及金钗石斛生物碱高、中、低剂量组均出现好转，其中金钗石斛生物碱高剂量组与对照组较为相似。见图1。

图1 HE染色观察大鼠海马CA1区病理变化(×400)Fig.1 HE staining to observe the pathological changes of hippocampal CA1 area (×400)

3.4海马CA1区神经元凋亡情况 细胞凋亡指数模型组高于对照组(P<0.05)，丁苯酞组及金钗石斛生物碱高、中、低剂量组均低于模型组(P<0.05)，与丁苯酞组比较，金钗石斛生物碱高剂量组降低(P<0.05)，低剂量组升高(P<0.05)，见图2、表4。

图2 TUNEL检测大鼠CA1区神经元凋亡(×400)Fig.2 TUNEL to detect the apoptosis of hippocampal CA1 neurons (×400)

表4 细胞凋亡指数检测结果Tab.4 Results of apoptosis indexes

3.5大鼠海马组织中Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相对表达量检测 Apaf-1、Caspase-9和Bax mRNA的相对表达量模型组均高于对照组(P<0.05)，丁苯酞组及金钗石斛生物碱高、中、低剂量组均低于模型组(P<0.05)，与丁苯酞组比较，金钗石斛生物碱高剂量组均降低(P<0.05)，低剂量组均升高(P<0.05)；Bcl-2 mRNA的相对表达量模型组低于对照组(P<0.05)，丁苯酞组及金钗石斛生物碱高、中、低剂量组均高于模型组(P<0.05)，与丁苯酞组比较，金钗石斛生物碱高剂量组升高(P<0.05)，低剂量组降低(P<0.05)，见表5。

表5 RT-qPCR检测大鼠海马组织中Apaf-1、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA的相对表达量 Tab.5 Relative mRNA expressions of Apaf-1，caspase-9，Bcl-2 and Bax in rat hippocampus detected by RT-qPCR

3.6大鼠海马组织中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表达水平检测 Apaf-1、Cleaved Caspase-9和Bax蛋白表达水平模型组高于对照组(P<0.05)，丁苯酞组及金钗石斛生物碱高、中、低剂量组均低于模型组(P<0.05)，与丁苯酞组比较，金钗石斛生物碱高剂量组降低(P<0.05)，低剂量组升高(P<0.05)；pro-Caspase-9、Bcl-2蛋白表达水平模型组低于对照组(P<0.05)，丁苯酞组及金钗石斛生物碱高、中、低剂量组均高于模型组(P<0.05)，与丁苯酞组比较，金钗石斛生物碱高剂量组升高(P<0.05)，低剂量组降低(P<0.05)，见图3、表6。

图3 WB检测大鼠海马组织中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表达水平Fig.3 Protein expression levels of Apaf-1，pro-caspase-9，cleaved caspase-9，Bcl-2 and Bax in rat hippocampus detected by WB

表6 WB检测大鼠海马组织中Apaf-1、pro-Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表达水平Tab.6 Protein expression levels of Apaf-1，pro-caspase-9，cleaved caspase-9，Bcl-2 and Bax in rat hippocampus detected by WB

4 讨论

OSAS的发病机制与众多因素有关，如吸烟、肥胖、基因遗传、年龄和性别等[6]。OSAS可导致包括认知、记忆功能障碍在内的全身多脏器渐进性疾病[7]。有研究表明，OSAS可引起海马和额叶皮层区损伤，导致认知障碍[8]。持续气道正压通气法可有效治疗OSAS，但患者常出现依从性差，导致该方法使用受限[9]。因此，寻找改善由OSAS导致的认知、记忆功能障碍的新疗法具有重要临床价值。金钗石斛是我国传统中药，具有清虚清热、滋阴养津的功效。生物碱是金叉石斛药效的主要成分，具有抗肿瘤、调节免疫和保护神经等作用[10]。有研究表明，金叉石斛生物碱可改善大鼠神经元损伤[11]。因此，本研究使用金叉石斛生物碱治疗OSAS大鼠认知、记忆力减退具有可行性。丁苯酞是临床常见的神经保护类药物，可抑制神经元凋亡，提高急性脑卒中、血管性痴呆等患者的认知和记忆能力[12]。因此，本研究使用丁苯酞作为阳性对照药物具有可比性。

旷场实验常被用于检测实验动物的认知能力，新位置识别实验则用于检测实验动物的记忆能力[13-14]。本研究旷场实验和新位置识别实验结果显示，OSAS模型大鼠表现出明显的认知、记忆障碍。旷场实验结果显示，OSAS大鼠自主活动能力、认知能力受限。新位置识别实验结果显示，OSAS大鼠短期识别记忆能力降低。经过金钗石斛生物碱处理后，OSAS大鼠认知、记忆能力均出现好转。海马是大脑神经元较丰富的区域，是大脑学习和记忆储存的解剖基础，同时也是对缺氧最敏感的区域之一，易出现神经元病变。本研究通过HE染色观察大脑海马CA1区病变，结果显示，OSAS大鼠神经元数量减少，神经元形态出现明显肿胀，核仁消失，细胞坏死。而经过金钗石斛生物碱处理后，海马CA1区组织病变明显好转，由此表明，金钗石斛生物碱可减轻大鼠海马CA1区组织病变。此外，TUNEL实验结果显示，经金钗石斛生物碱处理后，海马CA1区细胞的凋亡指数显著低于OSAS模型大鼠，由此可知，金钗石斛生物碱可抑制大鼠海马CA1区神经元凋亡。

Apaf-1是神经元凋亡过程中重要的分子之一，Apaf-1可释放细胞色素C，与Caspase-9形成复合物，诱导pro-Caspase-9裂解，形成Cleaved Caspase-9，从而启动细胞凋亡程序[15]。Caspase-9是Caspase凋亡级联瀑布反应的启动蛋白酶，是凋亡程序启动的开关[16]。有研究表明，在由脑缺血引起的神经功能缺失大鼠脑组织中可检测出Apaf-1/Caspase-9通路异常激活，引起下游Bax的表达升高、Bcl-2表达降低[17]。Bax是广泛存在于神经系统中发挥促凋亡作用的分子，与Bcl-2发挥拮抗作用，共同调节细胞凋亡[18]。神经细胞凋亡与大鼠认知、记忆能力障碍的发生有关。有研究表明，大鼠海马CA1区Bax表达增加、Bcl-2表达降低，可造成脑神经元凋亡，进而引起大鼠认知功能障碍[19]。本研究结果显示，OSAS大鼠海马组织中Apaf-1、Caspase-9、Bax mRNA和蛋白均呈高表达而Bcl-2呈低表达，经金钗石斛生物碱处理后，Apaf-1、Caspase-9、Bax mRNA和蛋白的表达水平均降低，而Bcl-2的表达水平升高，由此可推测，金钗石斛生物碱可改善OSAS大鼠认知、记忆能力障碍，可能与抑制Apaf-1/Caspase-9通路、下调Bax表达、上调Bcl-2表达有关。

综上所述，金钗石斛生物碱可改善OSAS大鼠认知、记忆力障碍，减轻其脑组织病理损伤，抑制细胞凋亡，推测其机制可能与抑制Apaf-1/Caspase-9通路、下调Bax表达、上调Bcl-2表达有关。影响OSAS大鼠认知、记忆力的因素较为复杂，金钗石斛生物碱是否通过影响其他因素发挥功效，尚有待进一步研究。