LC-MS/MS法测定甲磺酸萘莫司他有关物质

（河北省医疗器械与药品包装材料检验研究院，河北 石家庄 050227）

0 引言

甲磺酸萘莫司他（Nafamostatemesilate，1,图1a），化学名：6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸盐，分子量：539.58，是一种非肽类合成蛋白酶抑制剂，用于治疗胰腺炎、急性恶化的慢性胰腺炎，还用于血液透析，冠状动脉搭桥术，肝脏切除术时的抗凝[1-6]。肾小球肾炎伴系统性红斑狼疮或混合型冷球蛋白血症，还用于体外膜式氧合。临床剂型为冻干粉针注射剂。1由中间体对胍基苯甲酸盐酸盐和6-脒基-2-萘酚甲磺酸盐(3)酯化、成盐制得[7]。在研究中发现1化学性质不稳定，水、酸、碱、热、光均会使样品发生降解，分解为两种中间体。经研究确定1的有关物质就是这两种中间体的甲磺酸盐。1目前尚未载入《中国药典》2015年版，相关质量控制的研究报告很少，只有少量关于残留溶剂或痕量衍生杂质的研究报告[8-11]，对药物质量控制最重要的关键有关物质研究基本未见涉及，药品中的有关物质与药品在临床使用中产生的不良反应有很大关系，因此建立一种可靠的有关物质检验方法十分必要。本研究建立了LC-MS/MS法同时定性、定量测定1中的两种关键有关物质含量，检测迅速，避免了样品不稳定造成的影响，方法选择性强，灵敏度高，准确度高，能满足药品质量控制的需要。

1 试药与仪器

1.1 药品与试剂

甲磺酸萘莫司他原料药；对-胍基苯甲酸甲磺酸盐对照品(4-guanidinobenzoic acidmethanesulfonate，2，图1b)；6-脒基-2-萘酚甲磺酸盐对照品（6-amidino-2-naphthol methanesulfonate，3，图1c）；以上原料药和对照品均为实验室自制，纯度均符合质量标准(国内批准的首家临床产品标准)。乙腈（色谱纯）；甲酸（分析纯）；去离子水由EPED实验室级超纯水机制备。

1.2 设备

安捷伦1260-G6460型LC-MS/MS液相色谱-质谱联用系统。

2 LC-MS/MS条件及检测结果

2.1 色谱条件色谱柱

ZORBAX SB-C18(2.1*100mm,1.8um)，柱温：30℃；流动相：水-乙腈（30:70）,流速：0.2mL/min；进样量：2μL。

图1a 甲磺酸萘莫司他结构式

图1b 对-胍基苯甲酸甲磺酸盐结构式

图1c 6-脒基-2-萘酚甲磺酸盐结构式

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI源）；监测模式：正离子监测模式；毛细管电压：4000V；雾化气压力：50psi；干燥气流速：11L/min；干燥气温度：300℃；正离子全扫描范围50-600。碎裂电压：150V；碰撞能量25eV。

2.3 供试液制备

精密称定甲磺酸萘莫司他原料药20mg，至10mL容量瓶中，以甲醇定容，精密量取该溶液0.1mL至10mL容量瓶中，以流动相稀释，再次取所得溶液1mL至10mL容量瓶中以流动相稀释为供试品溶液。

2.4 采用LC-MS/MS联用获得1的一级、二级质谱图

裂解途径见图2a。一级图谱显示主要碎片为m/z348、187、162（图2b），m/z348为1脱去两个甲烷磺酸后的6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯，m/z187、162为1酯链断裂后的两个中间体碎片，二级图谱与两个中间体对-胍基苯甲酸甲磺酸盐（m/z180→163、m/z180→138）（图3c）和6-脒基-2-萘酚甲磺酸盐(m/z187→170、m/z187→143)（图4c）对照品的质谱图一致，确证其结构。

图2a 甲磺酸萘莫司他裂解途径

图2b 甲磺酸萘莫司他的一级质谱图

3 有关物质的测定

3.1 色谱条件

色谱柱ZORBAX SB-C18(2.1*100mm,1.8μm)；柱温：30℃；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈（30:70），流速：0.2mL/min；进样量：2μl。

3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI源）；监测模式：正离子监测模式；监测离子对m/z180→163、m/z180→138（2），m/z187→170、m/z187→143（3）；毛细管电压：4000V；雾化气压力：50psi；干燥气流速：11L/min；干燥气温度：300℃；正离子全扫描范围50-250；碎裂电压：80和90V；碰撞能量18和20eV。

3.3 定性判定

用液相色谱-串联质谱法照3.1,3.2的仪器条件对样品进行检测，结果做定性判定，如果检出的色谱峰的保留时间与标准品相一致，并且所选择的监测离子对的相对丰度比与标准样品的离子对相对丰度比相一致，m/z180→163(100%)、m/z180→137.7（9.1%）（2）；m/z187→170（100%）,保留时间0.781min(图3a,图3b)；m/z187→142.8（29.1%）,保留时间0.896min（3）(图4a,图4b)，则可以判断样品中存在该有关物质。

3.4 对照品溶液配制

分别精密称定2、3各20mg至10mL容量瓶中，以甲醇定容，配成浓度为2mg/mL的对照品储备液。精密量取该储备液适量，以流动相梯度稀释，配制成2的浓度为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和3的浓度为0.010μg/mL、0.025μg/mL、0.050μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL的系列浓度对照品溶液。

3.5 供试液制备

精密称定甲磺酸萘莫司他原料药20mg，至10mL容量瓶中，以甲醇定容，精密量取该溶液0.1mL至10mL容量瓶中，以流动相稀释，摇匀为供试品溶液。

图3 对-胍基本甲酸甲磺酸盐图谱

图4 6-脒基-2-萘酚甲磺酸盐图谱

3.6 标准曲线

在“3.1”和“3.2”项下液相色谱-三重四极杆质谱联用分析条件下，用对照品系列浓度的标准溶液（3.4）分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线。稀释样品在相同分析条件下检测，以空白基线噪音的3倍峰高对应的浓度为最低检出浓度。线性方程分别为2：y=144.90x+6633.4，r=0.9999，最低检出浓度0.01μg/mL；3：y=36.522x+131.59，r=0.9998，最低检出浓度0.004μg/mL，表明在浓度范围内两种有关物质检测的线性关系良好。

3.7 精密度试验

取待测样品照3.5制备样品测试溶液，按仪器测试条件重复测定6次，分别得到两种有关物质的含量结果，计算得两种有关物质含量的RSD分别为2.2%、3.1%，表明仪器精密度良好。

3.8 重复性试验

取待测样品照3.5平行制备6份样品溶液，按上述条件测定两种有关物质含量，计算得2、3的RSD分别为5.1%、3.2%，表明重复性良好。

3.9 加标回收率试验

取待测样品分别加入低、中、高三种浓度的两种有关物质标准溶液，照2.5制备样品测试溶液，平行试验2份。两种有关物质低、中、高三种浓度的平均回收率分别为2：97.9%、99.9%、101.4%和3：99.6%、98.3%、99.8%，表明该方法准确可靠。

3.10 有关物质的含量测定

取三批样品的测试液，每批平行两份，按上述条件测定，计算含量。测得三批样品中两种有关物质含量分别为：0.053%（2），0.31%（3）；0.11%，0.46%；0.092%，0.47%。

4 讨论

甲磺酸萘莫司他的化学性质不稳定，易分解，有关物质主要为两个合成中间体的甲磺酸盐。传统的液相色谱法和薄层色谱法检测时间长，灵敏度低，样品在检测过程中不可避免地有一定的分解，影响检测的准确性。在与大量液相色谱法和薄层色谱法结果比较后，我们发现采用LC-MS/MS法测定甲磺酸萘莫司他有关物质含量，分析时间短，灵敏度高，有比液相色谱法和薄层色谱法更低的检出限，具有更高的准确度。该方法同样适用于甲磺酸萘莫司他的含量测定，我们以2.1的色谱条件和2.2的质谱条件，监测离子对m/z348.1→162、m/z348.1→187，内标法定量，同样获得了满意的结果。有关物质标准品6-脒基-2-萘酚甲磺酸盐为药品制备中间体，可直接拿来使用，对-胍基苯甲酸甲磺酸盐需专门制备，比较麻烦，考虑到质谱本身的特点，我们尝试直接用中间体对-胍基苯甲酸盐酸盐代替甲磺酸盐做为标准品进行测定，结果也令人满意。必须注意的是样品的溶液稳定性差，应临测现配。该方法高效、准确，专属性强，重现性好，能满足药物生产质量控制的需要。