荧光免疫层析法定量检测CHI3L1的性能评价及其在肝纤维诊断中的应用

湖南省药品审评认证与不良反应监测中心 （湖南 长沙 410013）

内容提要： 目的：对采用荧光免疫层析法定量检测CHI3L1的试剂盒进行性能评价，以及评估CHI3L1在辅助肝纤维诊断的临床价值。方法：对厂家提供的CHI3L1试剂盒从空白检测限、精密度、准确度、特异性以及与肝组织活检结果的符合率等方面进行全面的方法学评价。结果：该试剂盒空白检测限＜5ng/mL；批内CV＜8.7%，批间CV＜9.8%；回收率95%～105%；与PCⅢ、AFP之间没有交叉反应，特异性好；肝纤维患者的血清CHI3L1的水平明显高于健康组，这两差异具有统计学意义（P＜0.05）；临床符合率为84.7%。结论：CHI3L1荧光免疫层析法试剂盒能够实现定量、灵敏、快速和准确检测，满足临床检测需求，在肝纤维的辅助诊断中具有一定的临床价值。

肝纤维化是肝脏组织对各种病因引起的肝脏炎症或损伤后自我修复过程中的代偿反应，在损伤因子的持续作用下，细胞外基质合成速度大于降解能力，导致细胞外基质过度沉积，形成肝纤维化[1]。肝纤维化是各种慢性肝脏疾病的病理基础，如不及时治疗可能向肝硬化和肝癌方向发展，并出现各种终末期肝脏并发症，严重威胁人类的生命健康[2]。研究表明，肝纤维化是形成与消退动态平衡的病理过程，肝纤维化可以通过干预消退逆转，早期诊断肝纤维化并及时进行有效治疗，有助于预防肝纤维化向肝硬化、肝癌等转化的发生[3-5]。目前，肝组织活检仍然是评估肝纤维化程度的金标准，然而其侵袭性、不便利性、取样误差以及存在并发症风险等弊端限制了其在临床上的应用[6]。因此，寻找反映肝脏损伤严重程度-尤其是肝纤维化程度的非侵入性诊断技术显得尤为迫切[7,8]。近些年来，随着体外诊断技术的发展，新型血清学标志物壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）在肝脏疾病中的诊断价值越来越引起研究人员的重视[9]。本研究旨在对采用荧光免疫层析法制备的壳多糖酶3样蛋白1试纸条的性能进行评价，并进一步探讨了CHI3L1在辅助肝纤维诊断的临床价值。

1.资料与方法

1.1 临床资料

以2019年1月～5月北京医院院内确诊的34例肝纤维患者作为研究对象，其中男性26例，女性8例，年龄32～65岁，其中酒精性患者12例、乙型肝炎患者14例、丙型肝炎患者8例。选取同期就诊的25例健康体检人员样本作为健康对照组，所有患者排除其他系统性疾病。

仪器和试剂：壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）试剂盒（荧光免疫层析法）；配套对应的荧光免疫层析分析仪。

1.2 方法

1.2.1 实验原理。将免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合，采用双抗体夹心法的原理，定量检测血清中CHI3L1的浓度。将血液样本滴加到试纸条的样品垫上，在吸水垫的作用下，血液样本向前层析，在标记物结合处血液样本中的CHI3L1与荧光微球标记的一株鼠抗人CHI3L1单克隆抗体反应形成荧光微球标记的CHI3L1免疫复合物，荧光微球标记的兔IgG不参加反应，随后沿着包被垫继续层析，荧光微球标记的CHI3L1免疫复合物与检测线包被的另一株鼠抗人CHI3L1单克隆抗体反应而停留在检测线，荧光微球标记的兔IgG与质控线包被的羊抗兔多克隆抗体反应而停留在质控线，其他物质继续层析，最后通过荧光免疫层析仪分别采集检测线的荧光微球的信号（记作T）和质控线的荧光微球的信号（记作C），计算T/C值，从仪器内置的CHI3L1的标准曲线中直接读取血液样本中CHI3L1的浓度。

1.2.2 空白检测限。随机抽取三批次的零浓度校准品，分别平行检测20次，计算测量值的平均值（M）和标准差（SD），计算测量值为M+2SD时的浓度即为空白检测限。

1.2.3 精密度。随机抽取两批CHI3L1试剂盒，15、50、100ng/mL浓度点各平行测定20次，分别计算两批次试纸条批内和批间变异系数（CV）。

1.2.4 准确度。抽取三个批次浓度为200ng/mL的CHI3L1校准品，分别加入到浓度接近于0的阴性血清样本中，其中所加入的CHI3L1校准品与阴性血清样本的体积比为1:9，重复测定10次，将理论值与测定值进行比较，计算回收率，回收率应在85%～115%。回收率=实际浓度/理论浓度×100%。

1.2.5 特异性。分别取51μg/mL的Ⅲ型前胶原（PCⅢ）和600ng/mL的甲胎蛋白（AFP）分别用CHI3L1（荧光免疫层析法）进行检测，15min后读取检测结果。

1.3 统计学分析

采用PSPP 20.0对搜集的材料进行统计学分析，计量资料以M±D表示，采用t检验，当P＜0.05时，差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 空白检测限

根据公式M+2SD计算，三个批次零浓度校准品的空白检测限依次为2.09、4.49、3.47ng/mL（见表1），均＜5ng/mL，该试剂盒具有较高的灵敏度。

2.2 精密度

随机抽取两个批次的CHI3L1试剂盒，分别对CHI3L1浓度为15、50、100ng/mL的样本进行测定，从表2中可以看出，批内变异系数＜8.7%，批间变异系数＜9.8%，说明该CHI3L1试剂盒（荧光免疫层析法）具有较高的精密度。

表1. 空白检测限的测定

表2. 精密度分析

表3. 特异性分析

2.3 准确度

抽取的三批CHI3L1校准品的回收率分别为103.24%、95.12%、104.38%，测定结果符合标准，表明该CHI3L1试剂盒（荧光免疫层析法）具有较好的精密度。

2.4 特异性

CHI3L1试剂盒（荧光免疫层析法）特异性的检测结果如表3所示，PCⅢ和AFP的测试结果均＜5ng/mL，表明该试剂盒与PⅢNP、AFP之间不存在交叉反应，抗体的特异性高。

2.5 统计学方法及临床符合率

厂家给定的CHI3L1试剂盒（荧光免疫层析法）的线性范围为5～200ng/mL，参考区间为＜79ng/mL。对两组检查人群的血清CHI3L1检测结果比较：肝纤维患者CHI3L1浓度明显高于健康组，P＜0.05，差异具有统计学意义（表4）。CHI3L1试剂盒（免疫层析法）与肝组织活检验的临床符合率为84.7%（表5），K值为0.6126，表明两种检测结果具有一致性。

3.讨论

壳多糖酶3样蛋白1（Chitinase 3-like protein 1，CHI3L1），又名YKL-40，分子量为42.6kD，是哺乳动物几丁质酶家族成员之一，可由软骨细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞、中性粒细胞以及滑膜细胞等分泌。研究发现，YKL-40是内皮细胞和成纤维细胞的生长因子，其血清浓度与由成纤维细胞和肝星状细胞（Hepatic stellate cell，HSCs）所分泌的细胞外基质有关，在肝脏组织中高度表达，通过参与促进细胞外基质重塑和炎症反应而参与到肝脏纤维化过程中[10]。Tran等[11]和Nøjgaard等[12]研究发现YKL-40在酒精性肝病患者的血清中有较高水平，并可能提供预后信息。曹欣等[13]对慢性乙型肝炎感染者血清YKL-40进行检测，研究发现血清YKL-40水平可以区分轻度与中重度肝纤维化。YKL-40在肝纤维化方面高灵敏度和特异性，可用于作为评估酒精性肝病，乙型肝炎和丙型肝炎等多种病因导致的肝纤维化的血清标志物[14-16]。目前市面上，YKL-40的试剂盒较少，主要为酶联免疫法，随着检验技术的发展，新型检测手段成为一种内在需求。

表4. 两组检测人群检测结果比较(ng/mL)

表5. 两检测人群检测结果符合率比较(n)

本研究采用的CHI3L1试剂盒（荧光免疫层析法）的空白检测限＜5ng/mL，回收率95%～105%，具有非常高的精密度。与PCⅢ、AFP之间没有交叉反应，特异性好。通过检测肝纤维患者与健康组的CHI3L1水平，两组人群检测结果差异具有统计学意义（P＜0.05）；临床符合率为84.7%。该方法的成本低、操作简单，能够实现即使检测，为临床辅助诊断肝纤维提供一种便捷可靠的途径。除此之外，从本研究中可以看出，CHI3L1试剂盒（荧光免疫层析法）与肝组织活检中存在一定的差异，这可能是由于以下几方面的原因产生的：①活检的样本太少，活检的部位太浅，活检的部位不是病理部位，医生的经验不足，判断失误；②试剂盒的准确性和特异性方面需要进一步完善等。实际临床应用中，单项血清学指标在诊断肝纤维方面存在一定的局限性，为了更准确、更好地评价肝纤维化以及其进展程度，需要联合其他血清学标志物进行检测。