程序性细胞死亡因子10抑制Ⅰ型干扰素表达并促进FMDV复制

曾宗波，马旭升，罗志宽，齐亚银，郑海学*

(1.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原学国家重点实验室，兰州 730046)

口蹄疫(FMD)是一种急性、烈性、高度接触性动物传染病。FMD主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物，临床以发热、口唇、蹄部和乳房形成水泡为特征。FMD的病原是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)。FMDV是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthoviru)的成员。FMDV有7种血清型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、STA3和Asia 1型。FMDV具有高度抗原变异，不同血清型间无抗原交叉保护现象[1]，同时FMDV属于典型的免疫抑制性病毒，感染宿主以后不仅会产生明显的免疫抑制反应，还会降低宿主的免疫力，增加宿主感染其他病原的风险[2]。

天然免疫应答反应是宿主抵御外来病原的第一道防线。模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，进而导致Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferons, IFNs)、炎症因子及其他效应因子产生，最终发挥抵御外来病原的作用[3]。细胞应答RNA病毒感染时，病毒RNA及病毒复制产生的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)被RIG-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ)和MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)细胞质RIG-Ⅰ样模式识别受体(RLRs)识别[4]，并被招募至定位于线粒体外膜的接头蛋白VISA(有文献也叫MAVS、IPS-1、Cardif)[5-9]，一方面VISA激活IKKα/IKKβ激酶复合体，最终释放NF-κB；另一方面，VISA激活TBK1/Ikk 激酶复合体，进而介导IRF3磷酸化和二聚化，激活的NF-κB和IRF3入核，最终导致Ⅰ型干扰素、炎症因子产生及下游抗病毒基因表达[10-12]。

多种宿主蛋白通过不同机制调控Ⅰ型干扰素产生在细胞抗FMDV天然免疫应答中发挥了重要作用。如酯酶D(esterase D，ESD)、膜联蛋白A1(annexin A1, ANXA1)等促进Ⅰ型干扰素产生，进而抑制FMDV复制[13-14]，DEAD-box RNA解旋酶(DDX56)、多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)、G3BP1(Ras GTPase-activating protein-SH3 domain-binding protein 1)抑制Ⅰ型 干扰素产生，进而促进FMDV复制[15-17]。

程序性细胞死亡因子10(programmed cell death factor 10, PDCD10)于1999年在去除了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子而被诱导凋亡的人髓系细胞系TF-1中克隆得到[18]。PDCD10是一个非常古老的基因，进化过程中高度保守，在人的心、脾、淋巴结、结肠等组织细胞中广泛表达[19]。早期的研究证实PDCD10与细胞调亡和血管生成密切相关，并作为一个接头蛋白在生物体内发挥重要作用[20]，且能与众多的信号蛋白相互作用并形成交互网络，调节细胞凋亡、增殖、极化、迁移和细胞骨架重塑等[21-25]。因此，PDCD10的异常表达可能会造成一个或多个信号通路中断或紊乱，打破机体细胞增殖与凋亡之间的平衡，但目前未见PDCD10参与调控Ⅰ型干扰素产生及病毒感染之间关系的报道。本研究拟探究PDCD10能否通过干预Ⅰ型干扰素表达进而影响FMDV复制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和病毒 HEK-293T细胞、PK-15细胞、仙台病毒(SeV)、FMDV/O/Mya98/2010毒株均由本实验室保存。

1.1.2 质粒 构建猪源pCAGGs-PDCD10重组质粒，pCAGGs空载体、TK质粒、IFN-β报告基因质粒、NF-κB报告基因质粒、pRK-RIG-I、pRK-MDA5、pRK-VISA、pRK-TBK1、pRK-IRF3等重组质粒均由本实验室保存。

1.1.3 主要试剂 DMEM 高糖培养基、MEM 培养基、opti-MEM 培养基、1%青霉素和链霉素溶液、0.25%胰酶溶液均购于GIBICO公司、胎牛血清(Biological Indu)；限制性核酸内切酶SmaⅠ和ClaⅠ；总RNA提取试剂盒和质粒大提试剂盒均购自Omega公司；反转录酶 M-MLV、RNA 酶抑制剂(RRI)、Oligo(dT)引物、随机引物、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、大肠杆菌 Trans5α感受态、TBgreen、ExTaqⅡ、蛋白Marker均购于TaKaRa公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于 Promega 公司；鼠抗myc单抗、鼠抗β-actin单抗均购自Sigma公司；HRP 标记山羊抗鼠IgG 二抗和HRP标记的山羊抗兔IgG二抗均购自中杉金桥公司；LipofectamineTM2000转染试剂购于 Invitrogen 公司。

1.2 pCAGGs-PDCD10重组质粒构建

参照猪源PDCD10基因序列(NCBI登录号：XM_013982176.2)，利用Primer Premier5设计扩增引物，分别引入酶切位点SmaⅠ和ClaⅠ。上游引物：5′-ATGAGGATGACAATGGAAGA-3′，下游引物：5′-TCAGGCCACAGTTTTGAAG-3′。提取PK-15细胞总RNA，反转录成cDNA，以此为模板进行PCR扩增，将扩增产物克隆于pCAGGs载体上，双酶切鉴定并测序。

1.3 双荧光素酶报告系统检测

将HEK-293T细胞接种于48孔板中，待细胞长至80%～90% 时，按照 LipofectamineTM2000说明书进行转染，每组试验设置3个重复，每孔转染萤火虫荧光素酶报告基因质粒4 ng、海肾荧光素酶报告基因质粒20 ng和相应的空载体或pCAGGs-PDCD10不同剂量质粒(50、100、200 ng)24 h后，SeV感染细胞，12 h后双荧光素酶报告基因试剂盒检测。

1.4 总RNA提取及实时荧光定量PCR

细胞总RNA提取按照Omega试剂盒说明书进行。本研究设置空载体组，空载体SeV感染组，pCAGGs-PDCD10重组质粒组，pCAGGs-PDCD10重组质粒SeV感染组。将细胞接种于60 mm培养皿中，待细胞长至80%～90%，按照LipofectamineTM2000说明书转染相应的质粒18 h后，SeV刺激，收集样品，提取细胞总RNA，试验操作过程确保无RNase，RNA提取完成后反转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR试验。反应体系：10 μL TB Green，上、下游引物各0.8 μL，0.4 μL ROXII，7.0 μL DEPC 水，1 μL cDNA。反应程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。定量引物详见表1，引物序列由上海生工公司合成。

表1 实时荧光定量PCR所用引物

1.5 Western blot

将HEK-293T细胞接种于60 mm 培养皿中，待细胞长到80%～90% 时，根据试验要求按照LipofectamineTM2000说明书瞬时转染pCAGGs-PDCD10重组质粒以及pCAGGs空载体质粒，收集细胞，处理样品，100 ℃变性10 min。蛋白上样跑SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将蛋白转印至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃过夜孵育一抗，TBST 洗膜5次，每次 5 min，室温孵育二抗1 h，TBST 洗膜5次，每次5 min，加入ECL发光液显色曝光。

1.6 数据分析

用 2-△△Ct分析方法计算不同试验的数值，计算后的数据用 GraphPad Prism 5进行分析，运用单因素方差分析法，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 pCAGGs-PDCD10重组质粒酶切鉴定及表达验证

为判断pCAGGs-PDCD10重组质粒是否构建正确，SmaⅠ和ClaⅠ双酶切后，琼脂凝胶电泳检测，结果如图1a所示，在639 bp见PDCD10条带，在5 000 bp 见空载体条带。经测序后确定该重组质粒构建成功。将成功构建的 pCAGGs-PDCD10重组质粒和空载体分别转染HEK-293T细胞24 h后，处理样品并进行Western blot试验，结果如图1b所示，表明PDCD10重组质粒在HEK-293T细胞中表达。

a.重组质粒酶切鉴定(M.DL5000 DNA相对分子质量标准；1.PDCD10基因扩增产物；2.pCAGGs-PDCD10重组质粒ClaⅠ和 SmaⅠ双酶切产物)；b.PDCD10-Myc在HEK-293T细胞中表达

2.2 过表达PDCD10促进FMDV复制

为确定PDCD10对FMDV复制的影响，在PK-15 细胞中，本研究设置试验组和对照组，分别转染PDCD10重组质粒和空载体18 h后，感染FMDV，设置不同时间点，收集细胞提取RNA反转录成cDNA，进行qPCR试验和Western blot试验，在mRNA水平和蛋白水平分别验证PDCD10对FMDV复制的影响，结果如图2所示，表明在mRNA水平和蛋白水平，PDCD10均显著促进FMDV复制。

a.qPCR检测过表达PDCD10不同时间点FMDV的复制，****.P<0.000 1; b.Western blot检测过表达PDCD10不同时间点FMDV的复制。EV.空载体(下图同)

2.3 沉默PDCD10抑制FMDV复制

为进一步确定PDCD10对FMDV复制的影响。本研究设计了3条靶向PDCD10的siRNA，将3条siRNA分别转染PK-15细胞，终浓度为100 nmol·L-1，24 h后qPCR检测，沉默效率如图3a所示，表明3条siRNA均能显著降低PDCD10基因转录。进而选择沉默效果最好的第3号siRNA进行后续试验，其序列：5′-CAUGUAUCCUGUGUUUAAUTT-3′，将该siRNA转染PK-15细胞18 h 后，感染FMDV(MOI=1)，再经过12 h qPCR检测FMDV的复制，结果如图3 b所示，表明沉默PDCD10能显著降低FMDV的复制。

a.PK-15中PDCD10沉默效率鉴定；b.qPCR检测沉默PDCD10后对PK-15中FMDV复制的影响；*.0.01

2.4 PDCD10促进FMDV复制与Ⅰ-IFN相关

由RLRs介导的Ⅰ型干扰素产生对机体抵御病毒入侵具有十分重要的作用，为探究PDCD10促进FMDV复制与Ⅰ型干扰素之间的相关性。首先，用IFN-β刺激PK-15细胞，4 h后感染FMDV(MOI=1)，12 h后qPCR检测FMDV的复制，结果如图4a所示，与对照相比，IFN-β能显著抑制FMDV的复制。其次，过表达PDCD10后感染SeV(MOI=1)12 h,收集上清液，并将上清液加到PK-15细胞中，4 h后感染FMDV(MOI=1)，再经过12 h qPCR检测FMDV的复制，结果如图4 b所示，与空载体组相比，过表达PDCD10的上清液能显著促进FMDV的复制。

a.用IFN-β处理或不处理PK-15细胞，qPCR检测FMDV的复制情况；b.过表达PDCD10并感染SeV，取上清处理PK-15细胞，qPCR检测FMDV的复制情况；*.0.01

2.5 PDCD10抑制IFN-β启动子和NF-κB激活

为进一步探究PDCD10如何影响FMDV的复制。本文探究了PDCD10是否影响病毒感染诱导的IFN-β启动子激活，分别将pCAGGS-PDCD10重组质粒、报告基因质粒和内参质粒以及空载体转染HEK-293T细胞18 h 后，感染SeV(MOI=1)，再经过12 h 处理样品，利用双荧光素酶报告基因系统检测，结果如图5所示，表明PDCD10可显著抑制SeV诱导的IFN-β启动子和NF-κB的激活，且呈剂量依赖性。

图5 PDCD10抑制SeV诱导的IFN-β和NF-κB激活

接着，为确定PDCD10抑制Ⅰ型干扰素产生的分子水平，本研究设置试验组和对照组，分别瞬时转染PDCD10质粒、报告基因质粒、内参质粒和Ⅰ型干扰素通路分子质粒，双荧光素酶报告基因系统检测，结果如图6所示，表明PDCD10分别抑制RIG-I、IRF3、IRF7诱导的IFN-β启动子激活，但是PDCD10不能抑制VISA、MITA、TBK1诱导的IFN-β启动子激活。

a～f.将Ⅰ型干扰素通路分子质粒分别与报告基因质粒共转染293T细胞18 h 后，双荧光素酶报告系统检测IFN-β的激活情况；*.0.01

2.6 PDCD10负调控RLRs通路分子的表达

为研究PDCD10对Ⅰ型干扰素信号通路分子转录水平的影响，本研究设置试验组和对照组，分别将pCAGGS-PDCD10重组质粒和空载体瞬时转染HEK-293T细胞18 h 后，感染SeV(MOI=1)，再经过12 h 收集样品，提取细胞总RNA，反转录成cDNA，进行实时实荧光定量PCR试验，结果如图7所示，表明感染SeV后，试验组的RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1的转录显著低于相应的对照组，但对IRF3和STING的转录没有影响。

a～f.HEK-293T细胞中过表达PDCD10，感染或不感染SeV 18 h 后，qPCR分别检测通路分子基因的表达；*.0.01

2.7 PDCD10负调控Ⅰ型干扰素下游ISGs的转录

为探究PDCD10对Ⅰ型干扰素下游ISGs转录水平的影响。本研究设置试验组和对照组，在HEK-293T细胞中分别转染pCAGGS-PDCD10重组质粒和空载体18 h 后，感染SeV(MOI=1)，再经过24 h，收集样品，提取细胞总RNA，反转录成cDNA，进行qPCR试验，结果如图8所示，表明感染SeV后，试验组的ISG20、ISG54、ISG56、CXCL10、RANTES的转录显著低于相应的对照组。

a～f.HEK-293T细胞中过表达PDCD10，感染或不感染SeV 18 h 后，qPCR分别检测Ⅰ-IFN下游ISGs的表达；*.0.01

3 讨 论

天然免疫是宿主抗病毒应答的第一道防线，一旦RNA病毒感染，模式识别受体RLRs识别病毒核酸，并与线粒体上的VISA结合，活化后的VISA招募TBK1与IKK激酶复合物，使得IRF3发生磷酸化并形成二聚体并入核，最终导致Ⅰ型干扰素的产生。Ⅰ型干扰素介导的干扰素刺激基因表达对宿主细胞清除外来病毒感染中具有十分重要的作用。适时、适量的Ⅰ型干扰素产生能有效抑制病毒复制，并诱导适应性免疫应答，最终免疫系统清除病毒[3],相反，Ⅰ型干扰素产生过量，会诱发自身免疫性疾病，甚至导致机体死亡[26]。由于不受控制的先天免疫反应对宿主是有害的，甚至是致命的，因此，宿主蛋白对于Ⅰ型干扰素信号通路的精准调控对于维持宿主的免疫平衡至关重要。近年来，研究证实许多正负调节因子通过不同的机制在多个水平上控制着先天性免疫信号通路。如当病毒感染后，研究表明，HAUS-augmin样复合物亚基8(HAUS8)通过靶向VISA复合物增强RLR-VISA依赖的抗病毒信号通路[27]。E3连接酶RIPLET结合多聚化的RIG-Ⅰ正调控RIG-Ⅰ，使得RIG-Ⅰ形成稳定的四聚体，最终与VISA结合[28]。相对于宿主蛋白正调控，当RNA病毒感染宿主细胞后，RIG-Ⅰ在第8个丝氨酸位点会发生磷酸化，但该位点的磷酸化可阻断E3泛素连接酶TRIM25对RIG-Ⅰ的泛素化修饰，从而负调控Ⅰ型干扰素产生[29]；磷酸酶PPM1B可以催化TBK1去除其172位丝氨酸的磷酸化修饰，负调控TBK1激活，从而抑制Ⅰ型干扰素产生[30]；此外，E3泛素连接酶RNF5可以催化VISA或MITA发生K48连接的多聚泛素化修饰并通过蛋白酶体途径被降解，从而负调控Ⅰ型干扰素产生[31-32]；AIP4能够催化VISA发生泛素化修饰进而被降解，负调控Ⅰ型干扰素产生[33]；ISG56是一种干扰素诱导蛋白，病毒刺激细胞以后，会产生大量的ISG56，但ISG56会破坏VISA与MITA复合物的组装，从而负调控IRF3的激活[34]。本研究发现宿主蛋白PDCD10能够显著抑制由SeV诱导的IFN-β和NF-κB的激活且呈剂量依赖性，并且在mRNA水平显著抑制Ⅰ型干扰素信号通路关键分子RIG-Ⅰ、MDA5、VISA和TBK1转录，导致Ⅰ型干扰素产生水平降低。同时对下游ISGs的研究发现，PDCD10显著抑制ISG20、ISG54、ISG56、CXCL10、RANTES等抗病毒基因转录，抗病毒基因由Ⅰ型干扰素调控表达，进一步说明PDCD10对Ⅰ型干扰素表达起负调控作用。双荧光素酶报告基因试验中，发现PDCD10能够抑制RIG-Ⅰ介导的干扰素的活化，但对其下游VISA介导的干扰素的活化没有影响，这间接说明PDCD10影响VISA上游的信号分子，如RIG-Ⅰ。同时PDCD10对于IRF3以及IRF7诱导的干扰素的表达也具有抑制作用，这说明在IRF3或IRF7分子水平，PDCD10也具有抑制功能。结合上述结果，PDCD10可能不仅仅定位于RLRs通路中的一个分子。目前，研究证实，PDCD10在不同种属间保守，在不同脏器中均有表达。同时，当病毒或细菌感染后，检测发现不同组织中PDCD10均有上调,高致病性H5N1禽流感病毒感染鸡胚成纤维细胞发现免疫相关基因PDCD10表达上调[35]。但PDCD10抑制Ⅰ型干扰素产生是首次被报道，PDCD10抑制Ⅰ型干扰素的具体分子机制仍有待进一步研究。

研究报道显示，Ⅰ型干扰素能够抑制FMDV的复制。本研究发现PDCD10能够促进FMDV复制，推测这与干扰素的合成具有相关性。因此通过与对照组相比，IFN-β刺激后的细胞能够显著抑制FMDV的复制，这与之前的研究相符[36]。同时，为了证实PDCD10介导Ⅰ型干扰素的降低，促进FMDV复制。本研究利用过表达PDCD10后，SeV刺激的细胞上清处理PK-15细胞，感染FDMV，结果显示FMDV复制增加。这进一步说明PDCD10能够通过抑制Ⅰ型干扰素产生，进而促进FMDV复制。因此，本文为认识宿主蛋白正向调控FMDV复制提供了新视角，但是其具体机制仍有待下一步研究。

4 结 论

宿主蛋白PDCD10负调控Ⅰ型干扰素产生，而促进FMDV复制，本研究为进一步探究PDCD10调控宿主抗病毒天然免疫的机制奠定了基础。