MTHFR C677T基因多态性与孤独症谱系障碍易感性关系的Meta分析

张宇昕，盖聪，杨璐平，马浩洁，张锦坤，孙红梅，胡蝶

孤独症谱系障碍（ASD）是一种常见的儿童神经发育障碍，其典型症状包括社交行为和沟通缺陷、兴趣受限和重复行为等［1-2］。ASD 的病因尚不完全明确，其发病受遗传、环境等多种因素的影响［3］。DNA甲基化作为最重要的表观遗传学修饰之一，对大脑的生长、发育和认知功能至关重要［4］。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）为叶酸代谢途径的关键酶，在DNA 的合成及甲基化中具有重要作用［5］。MTHFR基因多态性可通过改变DNA 甲基化和叶酸代谢降低MTHFR 酶活性，可能与ASD 等神经障碍有关［6］。目前已有较多关于MTHFR基因多态性与ASD 风险之间的研究，但结论存在一定争议。因此，本研究采用Meta 分析的方法对已有研究进行统计，以明确MTHFRC677T 基因多态性与ASD 易感性之间的关系。

1 资料与方法

1.1 文献检索 对中国知网（CNKI）、万方数据、PubMed、Embase、Proquest、Web of science等数据库进行全面的文献检索。中文检索词为“亚甲基四氢叶酸还原酶”、“孤独症谱系障 碍”、“ 孤 独 症”、“ 自 闭 症”；英 文 检 索 词 为“methylenetetrahydrofolate reductase”、“MTHFR”、“autism spectrum disorders”、“autism”、“ASD”，检索2020 年6 月30 日之前发表的所有MTHFR基因多态性与ASD易感风险关系的中英文相关出版物。

1.2 文献纳入与排除标准 纳入标准：（1）病例组患者符合《精神障碍诊断和统计手册》（diagnostic and statistical manual of mental disorders，DSM）或儿童孤独症评定量表（childhood autism rating scale，CARS）诊断标准。（2）有关MTHFRC677T基因多态性与ASD 发生风险关系的公开发表文献。（3）病例组和健康对照组的基因型频率符合Hardy-Weinberg 平衡（HWE）。排除标准：（1）重复发表文献、动物研究及综述文献。（2）非病例对照研究文献。

1.3 文献筛选及资料提取 通过阅读文献的标题和摘要进行初筛，而后阅读全文进行二次筛查，最终根据纳入标准决定文献是否纳入，意见不同时通过讨论或第3位研究者协助判断。从每项确定的研究中提取出以下信息：第一作者、发表年份、国家、种族、样本量、基因型信息和所有研究等位基因的频率。如果文献中没有给出上述信息，则通过联系作者获得。

1.4 文献质量评价 由2名研究者独立进行评价，结论出现不一致时讨论协商或第3研究者协助判断解决。计算纳入文献中对照组的基因型频率是否符合HWE，若P≤0.05，代表文献质量较低；若P＞0.05，则该文献质量较高。同时使用纽卡斯尔-渥太华量表（NOS）进行文献质量评价，从研究对象的选择、组间可比性和暴露因素的测量3个方面进行评价，共包含8个条目，共计9分，得分≥5分为高质量研究。

1.5 统计学方法 所有的统计分析使用Stata 14.0 软件，MTHFR多态性与ASD 之间的关系采用OR值和95%CI进行评估。分别计算等位基因模型（Tvs.C），显性模型（TT+CTvs.CC），纯合子模型（TTvs.CC）和隐性模型（TTvs.CT+CC）的OR值及其95%CI，并进行种族亚组分析。采用χ2检验判定基因型在对照组的分布是否符合HWE。采用I2检验文献的异质性，检验水准α=0.05，若P＞0.05 且I2≤40%，说明异质性小，选择固定效应模型；若P≤0.05 且I2＞40%，说明各研究之间存在较高异质性，选择随机效应模型进行分析。通过敏感性分析来检验结果的稳定性，为了控制潜在的发表偏倚，采用漏斗图并通过Egger线性回归检验进行分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入文献基本特征 经文献筛选后共纳入16篇文献［7-22］，其中病例组2 149 例，对照组2 251 例，文献筛选流程及结果见图1，纳入文献的基本资料见表1，NOS质量评分均≥7分。

Fig.1 Pictures showed the literature screening process图1 文献筛选流程图

2.2 MTHFR分析结果

2.2.1 MTHFR T 等位基因与ASD 发病之间的Meta分析 各研究结果存在异质性（I2=85.7%，P＜0.001），采用随机效应模型进行Meta 分析。ASD 组和对照组携带T等位基因分别为1 528例、2 770例，C等位基因分别为2 770例、3 084例。以T等位基因为暴露因素，C等位基因为非暴露因素进行分析，结果显示，携带T 等位基因者发生ASD 的风险是携带C 等位基因的1.51 倍（OR=1.51，95%CI：1.15～1.99，P=0.003）。种族亚组分析显示，亚洲人携带T 等位基因者发生ASD 的风险是携带C 等位基因人群的1.85 倍（P=0.014）；而在高加索人及非洲人组中，携带T等位基因者发生ASD的风险与携带C等位基因无关（高加索人OR=1.20，P=0.102；非洲人OR=2.17，P=0.354），见图2。

Tab.1 Basic features of MTHFR C677T included in the study表1 MTHFR C677T纳入研究的基本特征

Fig.2 The Meta analysis forest map between MTHFR gene C677T polymorphism(T vs.C)and ASD图2 MTHFR基因C677T多态性（T vs.C）与ASD发病的Meta 分析森林图

2.2.2 显性模型TT+CTvs.CC与ASD发病的Meta分析 各研究结果存在异质性（I2=80.8%，P＜0.001），采用随机效应模型进行Meta 分析。ASD 组和对照组TT+CT 基因型分别为1 248 例、1 149 例，CC 基因型分别为901例、1 102例。以TT+CT 基因型为暴露因素，CC基因型为非暴露因素进行分析，结果显示，携带TT+CT 基因型人群发生ASD 的风险是携带CC基因型的1.67倍（P=0.002）。种族亚组分析显示，高加索人携带TT+CT 基因型人群发生ASD 的风险是携带CC 基因型的1.30 倍（P=0.024）；亚洲人携带TT+CT 基因型人群发生ASD 的风险是携带CC 基因型人群的1.99 倍（P=0.010）；而在非洲人组中，携带TT+CT 基因型人群发生ASD 的风险与携带CC 基因型无关（OR=2.51，P=0.324），见图3。

Fig.3 The Meta analysis forest map between MTHFR gene C677T polymorphism(TT+CT vs. CC)and ASD图3 MTHFR基因C677T多态性（TT+CT vs. CC）与ASD的Meta分析森林图

Fig.4 The Meta analysis forest map between MTHFR gene C677T polymorphism(TT vs. CT+CC)and ASD图4 MTHFR基因C677T多态性（TT vs. CT+CC）与ASD Meta分析森林图

2.2.3 隐性模型TTvs.CT+CC与ASD发病的Meta分析 见图4。各研究结果存在异质性（I2=61.7%，P＜0.001），因此采用随机效应模型进行Meta 分析。ASD组、对照组TT基因型分别为280例、269例，ASD组、对照组CT+CC 基因型分别为1 869 例、1 982 例。以TT基因型为暴露因素，CT+CC基因型为非暴露因素进行分析，结果显示，携带TT 基因型人群发生ASD的风险与携带CT+CC基因型无关（OR=1.20，P=0.340）。在种族亚组分析中，3组Meta分析结果均显示携带TT 基因型人群发生ASD 的风险与携带CT+CC 基因型无关（高加索人：OR=1.19，P=0.376；亚洲人：OR=1.46，P=0.309；非洲人：OR=1.69，P=0.618）。

2.2.4 纯合子模型TTvs.CC 与ASD 发病的Meta 分析 各研究结果存在异质性（I2=67.5%，P＜0.001），采用随机效应模型进行Meta 分析。ASD 组、对照组TT 基因型分别为280 例、269 例，ASD 组、对照组CC基因型分别为901例、1 102例。以TT基因型为暴露因素，CC基因型为非暴露因素进行分析，结果显示，携带TT基因型人群发生ASD的风险与携带CC基因型人群差异无统计学意义（OR=1.43，P=0.113）。种族亚组分析均显示携带TT 基因型人群发生ASD 的风险与携带CC基因型人群差异无统计学意义（高加索人：OR=1.36，P=0.205；亚洲人：OR=1.72，P=0.165；非洲人：OR=2.47，P=0.490），见图5。

2.3 敏感性分析 通过逐一排除研究的方法进行敏感性分析，Meta 分析结果显示各效应量无明显改变，证明结果具有稳定性，见图6。

2.4 发表偏倚 通过漏斗图和Egger线性回归法检验发表偏倚，各基因型漏斗图可观察到各独立研究OR在坐标轴上围绕漏斗图的中心线散开，各基因型Egger检验结果均P＞0.05（Tvs.C，t=2.040，P=0.061；TT+CTvs.CC：t=1.923，P=0.076；TTvs.CT+CC，t=1.711，P=0.109；TTvs.CC，t=1.730，P=0.106），提示本研究无明显发表偏倚。见图7。

Fig.5 The Meta analysis forest map between MTHFR gene C677T polymorphism(TT vs. CC)and ASD图5 MTHFR基因C677T多态性（TT vs. CC）与ASD的Meta分析森林图

Fig.6 The impact of sensitivity analysis studies in Meta-analysis on the combined results图6 Meta分析中的敏感性分析调查研究对合并结果的影响

Fig.7 Funnel plot for publication bias test in the four genetic models图7 各遗传模型的发表偏倚漏斗图

3 讨论

叶酸主要参与甲基化循环以及DNA 和RNA 的生物合成，叶酸代谢障碍可导致机体氧化应激易感性，增加ASD的发病风险［23］。MTHFR是单碳代谢过程中叶酸和同型半胱氨酸代谢的关键酶。它将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，并参与DNA 甲基化相关的叶酸和同型半胱氨酸的转化［24-25］。遗传因素与ASD 的发生密切相关，人类MTHFR基 因 定 位 于 染 色 体1p36.3［26］，经 鉴 定MTHFR基因有14 个与酶缺陷相关的单核苷酸多态性位点，其中C677T基因位点是研究最多、在临床上最重要的变异之一。C677T的变化是由于胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，导致在密码子222 位点的缬氨酸转化为丙氨酸［27］，显著降低MTHFR酶的活性和血浆同型半胱氨酸的浓度，导致神经和血管功能障碍，继而影响大脑功能［28］，而这种改变可能会增加ASD 的易感性。

近年来关于MTHFR基因多态性与ASD 易感性的研究较多，但结论尚不完全统一，因此笔者收集了相关文献进行Meta 分析。本研究共纳入了16 篇文献，其中6篇表明MTHFRC677T多态性与ASD发生无关［9，10，14，16，18，20］，而其他文献表明MTHFRC677T 多态性增加了ASD的易感性［7-8，11-13，15，17，19，21-22］。本研究从等位基因模型（Tvs.C）、显性模型［（TT + CT）vs.CC］、纯合子模型（TTvs.CC）和隐性模型［TTvs.（CT+CC）］进行综合分析，结果显示在等位基因模型和显性模型中MTHFRC677T 多态性与ASD 发生具有相关性。种族亚组分析显示，高加索人仅在显性模型中MTHFRC677T多态性与ASD发生密切相关，而亚洲人在等位基因模型和显性模型中均具有相关性。Sadeghiyeh 等［29］通 过Meta 分 析 也 得 出MTHFRC677T多态性可能会增加ASD易感性的结论。本研究相比于既往的Meta分析，进行了数据更新以完善统计的精确度，且排除了对照组及病例组各基因型分布频率不符合HWE 的研究，使结论更具有说服力。此外，本研究还纳入了有关非洲人种的相关文献，并进行了敏感性分析及发表偏倚检测，其结果也提示分析的结论是较可靠的。

然而本研究还存在不足之处：（1）文献合并分析后异质性较大，进行种族亚组分析后不能明显降低其异质性。Park 等［16］发现男性患病率大于女性，提示异质性来源可能与性别有关，但大部分研究未报道不同性别各基因型的详细数据，无法进行性别亚组分析。（2）纳入的部分研究样本量偏小。

综上所述，MTHFRC677T多态性与ASD易感性具有一定相关性，高加索人仅在显性遗传基因型中MTHFRC677T多态性与ASD发生密切相关，而亚洲人在等位基因模型和显性模型中均具有相关性。