微生物发酵法制备活性多糖的研究概述

刘袆帆,林诺怡,成坚,马路凯,陈乃驿,冯浩锴,王琴

(仲恺农业工程学院 轻工食品学院,广东 广州,510225)

多糖作为一种结构复杂的高分子化合物,主要由醛糖和酮糖通过糖苷键组成,是通过2种或以上单糖按一定比例组成的聚合物,其支链连接形式复杂多样。多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、降血糖及免疫调节等多种生物活性,已成为食品科学、生命科学及医药领域的关注热点。目前,多糖提取的方法主要包括溶剂提取法、酶提取法和超声波提取法等[1],主要原理是基于多糖不溶于乙醇,易溶于水的物理性质,但提取多糖后剩余的物质将无法被利用而丢弃,造成原材料的浪费。

微生物发酵法是生物转化法的一种,是指利用完整的微生物细胞作为生物催化剂,与酶转化法相比而言,使微生物发酵产酶过程与酶作用过程合二为一,其本质是外源化合物被生物体系中所含有的酶催化,该催化反应类型复杂,几乎囊括所有的体外有机化学反应,它不同于简单的生物降解或生物合成,从而缩短了整个生产周期,降低了生产成本,提高活性多糖的生产效率[2]。原材料中的碳源、氮源、无机盐等能被微生物的生长所利用,但微生物不能直接利用多糖,从而能达到对多糖的纯化分离及富集的目的[3-4]。本文围绕微生物法制备发酵多糖,总结了国内外的相关研究成果,从多糖发酵菌种、发酵工艺、合成途径及结构、活性4个方面阐述微生物发酵法制备多糖的研究进展,希望能促进其在各个领域的研究运用。

1 发酵菌株

活性多糖的发酵菌株一般为食用真菌[5-6]、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、链霉菌[7-8]、克劳氏芽胞杆菌、纳豆芽孢杆菌[8]、非解乳糖链球菌[9]、乳酸菌[10-11]、曲霉、内生真菌等,见表1。对高产菌株进行选育并实现多糖大规模生产是微生物发酵法制备多糖的第一步,也是多糖的开发与广泛应用的重要难题。

目前,从动物、植物和海洋藻类中提取的多糖占主导地位,但也有许多微生物(如革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、古细菌、真菌以及一些微小藻类)能产生胞外多糖。已大量投入生产的微生物胞外多糖主要是由白串珠菌、假单胞菌、黄单胞菌等合成的黄原胶、葡聚糖、热凝多糖和结冷胶等,作为生物絮凝剂、生物吸附剂、给药剂等广泛应用于食品、医药、化工等行业。由于许多“药食同源”的真菌含有抗肿瘤、抗菌、降血脂、降血压、免疫激活、保肝、防血栓等多种功能,利用真菌产活性多糖成为研究热点,如盛悦[12]对猴头菌 He-02 进行液体发酵得到胞外多糖，其产量为 29.37 mg/mL。裴智鹏等[13]采用10种不同的灵芝菌株发酵得到灵芝多糖,在培养至第7天时,G0023和G0160菌株胞外粗多糖含量分别为3.02和3.14 g/L,多糖得率分别达到了84.11%和91.03%,可作为发酵高产胞外多糖的优良菌株。

菌种发酵的目的除了可以提高多糖产量外,还可以起到增强活性的作用。王丹等[14]分别比较了面包酵母、酿酒酵母、红曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌在发酵过程中多糖含量和多糖活性的变化,结果发现,发酵后的铁皮石斛多糖对自由基的清除能力和体外降血糖能力明显提高,红曲霉和面包酵母可以明显提高铁皮石斛对自由基的清除和体外降血糖能力,说明发酵可以作为增强铁皮石斛功能和开发铁皮石斛保健品的重要手段之一。张倩茹[15]采用植物乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌发酵玉米芯,结果发现未发酵和发酵玉米芯粗多糖对DPPH自由基、羟基自由基的清除率以及还原力都随浓度的提高而升高,且发酵玉米芯粗多糖的抗氧化能力显著高于未发酵玉米芯粗多糖。利用微生物培养法生产活性多糖具有广泛的应用前景,同时也可以大幅度减少环境污染。因此,微生物发酵菌种问题的解决将会给活性多糖的实际生产带来巨大的商业价值和社会效益。

表1 多糖发酵菌株与发酵工艺参数Table 1 Fermented polysaccharides and fermentation strains

2 多糖发酵工艺

2.1 培养基及培养条件的优化

为提高多糖产出率,可从培养基组成和培养条件两方面分别进行优化。从培养基的配方优化而言,微生物生长所需的多种碳源、氮源均会对其生长造成不同的影响,从而导致最终的多糖产量出现偏差,而培养条件如温度、pH和时间,则很大程度上决定了微生物的生长质量[25]。为了使发酵效率达到最大化,优化得出最佳的碳源、氮源及无机盐浓度等影响因素,将多糖产量和生物量作为指标,对培养基进行实验优化,如对于出芽短梗霉,采用多种不同碳源进行培养,得出蔗糖为发酵普鲁兰多糖的最佳碳源[26],因在蔗糖作为唯一碳源的情况下,合成普鲁兰多糖的转化率最为高效,已普遍得到学者们的认同。LIN等[27]发现通过调整培养基组成和培养条件,能够大幅度提升菌丝体和多糖产量,且发现能够使用深层发酵方法生产姬松茸菌丝体、并能提高多糖发酵效率。兰蓉等[28]利用正交实验,筛选出白灵菇液体发酵的最佳培养基组成：葡萄糖2%、蛋白胨0.75%、CaCl20.2%；白灵菇液体发酵产胞外多糖的最佳发酵条件为：起始pH值7.0,接种量20%,装液量120 mL,培养6 d。郭霞等[29]对药用真菌桑黄培养基进行了优化,最终确定了优化培养基(g/L):蔗糖50、玉米浆3.0、KH2PO410.0、MgSO41.0、CaCl23.0、VB12.0×10-4,且在此情况下,胞外多糖合成速度更快,相比于摇瓶法,生产最大值和生产强度分别提高了26.5%和50%。

2.2 发酵参数与模式的优化

目前,对于微生物发酵制备多糖方法的研究仍然处于起步阶段,当前最主流的发酵方法有3种：固态发酵法、深层液态发酵法和双向发酵法。

液态发酵法的发酵原理是将菌体接种到液体培养基中,根据其最佳的发酵条件进行培养,后将菌体产生的多糖在液体培养基的成分中进行分离纯化操作,从而获得目标产物。由于液体介质的特性,生长的菌种具有生产周期短和菌龄平均的优点,更有利于生产效率的提高与产物质量的规范。赵俊杰等[17]对香菇进行液态发酵实验,在短时间内获得大量的香菇多糖产物,并在最大程度上提高了香菇B08的生产效率。与传统法相比,液态发酵法具有生产周期短,不受季节、环境和地区的限制,短时间内可得大量目标产物等优势,但也存在易受污染、产品纯度低及多糖提取率低等缺陷。

固态发酵法的发酵原理是将菌体先接种在液态培养基中培养一段时间,达到快速增加菌种数量,后转移至固态培养基中进行后续培养,此方法产出的多糖主要集中于菌丝体和固态培养基中,便于进行产物分离操作。固态发酵法具有成本低廉,发酵过程不容易造成污染的优点,但产量低、发酵周期过长。因此,如何提高多糖产量和缩短发酵时间,成为了优化固态发酵法的关键。董玉玮等[30]以低品质牛蒡作为营养基质,优良灵芝菌种作为发酵菌株,发酵后多糖含量为24.85 mg/g。辛燕花等[31]以灵芝菌株作为出发菌株,以银杏叶作为基质,通过双向发酵工程技术,优化得到灵芝-银杏双向固态发酵的最佳条件。

微生物发酵法有其独特的优势,能够以低廉的成本、大幅度提高产率、生产周期短、不受季节影响和生产工艺简单等优点,而对于多糖的发酵生产,生产成本及产多糖的效率是应考虑的两大因素。

3 细菌多糖的生物合成途径

目前的研究方向大多集中于细菌多糖的合成途径,特别是对于乳酸菌多糖的生物合成,而对于真菌多糖的合成途径的研究尚处起步阶段。虽然合成的多糖具有不同的单糖种类及数量,但细菌多糖主要的合成途径却很相似,主要为以下4个步骤：前体核苷酸糖(单糖的活化形式)的合成；合成的起始反应；重复单元的延伸、翻转和聚合及多糖的输出[32],即是将单糖通过糖基转移酶从核苷酸糖转移,并连接到脂类载体形成重复单元,随后是重复单元的聚合和输出,形成细胞表面多糖,是多种酶和转运系统的结果,发生的部位包括胞内和胞外,有些合成过程会发生在细胞壁上。

3.1 前体核苷酸糖的合成

多糖主要分成两种不同的类型：同型多糖和异型多糖,不同类型多糖的前体糖苷酸合成途径也各不相同。异型多糖的核苷酸合成途径更复杂多样,虽然合成的多糖具有不同的单糖种类及数量,但其生物合成途径却有着相似的步骤,如图1所示。以葡萄糖作为主要碳源,通过转移酶进入细胞后,通过葡萄糖激酶转化葡萄糖-6-磷酸这一基本代谢途径,之后经过3个途径：1)通过α-磷酸葡糖变位酶转化为葡萄糖-1-磷酸,此途径为多糖生物合成的必经途径,后合成TDP-葡萄糖、TDP-鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖醛酸；2)葡萄糖-6-磷酸转化为GDP-甘露糖和GDP-岩藻糖；3)通过酶促反应,将6-磷酸葡萄糖转变为果糖-6-磷酸,然后产生UDP-n-乙酰基半乳糖胺和GDP-果糖,同时果糖-6-磷酸还能够进入糖酵解途径产生丙酮酸,并通过厌氧途径将其转化为乳酸,或通过需氧途径进入柠檬酸循环以产生ATP和其他产物,这些ATP为多糖合成提供能量保障[33]。以果糖作为发酵碳源,进入细胞后转化为果糖-6-磷酸,后转化为丙酮酸进入三羟酸代谢循环。而以乳糖作为碳源,经β-半乳糖苷酶等转化为葡萄糖-6-磷酸,后进入核苷酸糖的合成。各个途径中涉及的碳源和转换结构不同,合成过程中用到的关键酶也有所不同,但其合成过程均包含α-葡萄糖基磷酸变位酶,UDP-葡萄糖焦磷酸化酶,UDP-半乳糖4-表异构酶和葡萄糖磷酸异构酶[34]。

1-葡萄糖激酶;2-α-磷酸葡糖变位酶;3-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶;4-鼠李糖合成酶系;5-UDP-葡萄糖焦磷酸化酶;6-UDP-半乳糖-4-差向异构酶;7-NAD连接的脱氢酶;8-磷酸甘露糖变位酶 9-GDP-甘露糖焦磷酸化酶;10-脱水酶和GDP-岩藻糖合成酶:11-磷酸葡糖异构酶;12-β-半乳糖苷酶;13-半乳糖苷变旋酶;14-半乳糖激酶;15-半乳糖-1-磷酸转移酶；16-UDP-木糖-4-差向异构酶；17-转移酶；18-聚合酶图1 多糖核苷酸前体的合成Fig.1 Synthetic pathway of polysaccharides

因此,对磷酸葡糖变位酶和葡萄糖焦磷酸化酶进行基因克隆,提高关键酶的表达量来使得生物代谢途径偏向多糖的生物合成,以此来提高多糖生物合成量[35]。

3.2 合成的起始反应

多糖的合成阶段主要受调控基因、链长决定基因、重复单元合成基因、聚合及输出基因等胞外多糖生物合成基因簇所控制。通过糖基转移酶,将核苷酸糖转移到脂载体上,在细胞质膜的内表面启动重复单元的合成[33]。不同的糖基转移酶类型及数量决定重复单元的组成及大小,目前只能通过基因簇判断有哪些核苷酸糖前体组成,还无法推测出排列顺序以及基因调控重复单元组装的具体过程。

3.3 重复单元的延伸、翻转和聚合

在细胞膜和细胞壁上的酶作用下,组装好的重复单元最终被运送到指定的位点形成粘液或者包裹在细胞周围。重复单元翻转和聚合有3种不同的机制：Wzy-dependent 途径、ABC-transporter dependent 途径和 synthase-dependent 途径。多数异型多糖是通过Wzy-dependent 途径合成的,需要链长决定基因及Wzx、Wzy 和 Wzz蛋白参与运输及组装,糖重复单元在Wzx酶的作用下从细胞膜的胞质侧翻转到周质空间,并在OPX家族的周质蛋白、PCP周质蛋白、聚合酶Wzy 和 Wzz作用合成多糖链。ABC-transporter dependent 途径较特殊,一般存在于E.coliO8、O9、O52 等的 O-抗原及荚膜多糖群的合成中。synthase-dependent 途径最为罕见,是通过β-Barrel通道蛋白等将糖链运输至指定位点,目前只在Salmonellaenterica质粒编码的O54 抗原的合成中观察到[36]。

3.4 多糖的输出

重复单元完成聚合、延伸后,需将重复单元聚合并分泌到胞外,李欧[33]发现PaenibacilluselgiiB69胞外多糖的相关ORFs包括：包括pelE、pelF、pelG、pelH、pelL和pelM基因,其中pelH和pelM都与O-抗原转运蛋白具有相似性,Pel基因簇中的pelG及pelL与Wzy具有一定的相似性,可能作为聚合酶参与多糖的合成。关于多糖的输出研究较少,其主要的研究都集中在E.coli,3种途径的糖链组装及翻转方式是相同的。

4 多糖结构及活性

4.1 发酵法制备多糖的结构改变研究

多糖的结构极其复杂,从一级结构到四级结构不等。因高级的空间结构过于复杂,目前大量研究是基于多糖的化学结构中最基础的一级、二级结构上[37]。多糖的结构,主要研究的是单糖组成、糖苷键类型、糖残基连接顺序、位点、糖环类型、分子质量以及羟基取代情况等。近年的研究表明,利用发酵可以改变多糖的结构特征,由于物质的性质决定于其结构,进而提出通过发酵法来改变多糖功能活性,提高多糖利用度的方法。在冯炘等[38]的研究中,设立对照组多糖和发酵组多糖,通过电镜分析和红外分析其结构表明,虽然2组多糖均主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖构成,但其摩尔比发生了改变,由1∶4.6∶6.5∶1.4∶2.9∶2.5变为1∶13.4∶16.8∶3∶2.7∶8.4,其中,木糖与葡萄糖的比例有显著上升。高鹤[39]研究发现,用植物乳杆菌NCU116发酵的苦瓜多糖,其多糖的蛋白质含量、分子质量甚至单糖组成均发生了改变。

4.2 发酵多糖的活性研究

发酵功能性多糖普遍具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌和增强免疫等功效。研究表明,微生物发酵可以改变一些多糖的功能活性[40],如王丹等[14]对发酵前后的铁皮石斛多糖功能活性进行研究对比后发现,经面包酵母发酵后得到的铁皮石斛多糖,还原糖含量降低,且体外抗氧化活性和降血糖活性均增强。王文文等[20]将实验对象分为3组,将发酵麸皮多糖0、100、200 mg/kg BW分别灌胃大鼠,低剂量 (100 mg/kg BW) 发酵麸皮多糖可增强大鼠的免疫能力,机理是通过改变组织中细胞因子含量并调节其盲肠的菌群结构,来增强其免疫活性,表明了发酵麸皮多糖具有一定的免疫活性。于婷等[41]称发酵后的桔梗提取物中的多糖使机体对DPPH自由基和羟自由基的清除能力有显著提高,且提取物中的其他物质也表现出一定的抗氧化活性,如多酚类物质和总黄酮类物质,表明了桔梗提取物的抗氧化活性不仅只有多糖成分在起作用,而是多种物质共同作用的结果。由于多糖具有丰富的生物活性,对医药、食品等行业有着重要应用意义。虽然多糖的活性作为当前研究热点,但仍需更深入创新,根据多糖活性不同的用途,依据其多糖理化性质,使用物理、化学等修饰方法,开发出更多的活性,得到更好的应用效果,为多糖的发展奠定基础。

5 结论与展望

多糖具有多种生物活性,对医药学领域与食品保健行业的发展都具有重大意义,应用前景广泛。尽管目前对于多糖提取的研究已经取得一定成果,但仍存在提取率低、成本高、不易被人体吸收等缺点,目前还只停留在实验室阶段,无法应用到工业化生产上。因此,为开发出高效低耗,大规模生产应用的发酵工艺,还需要做到以下几点：通过多种方法的联合优化,优化多糖发酵工艺,深入研究已有方法的发酵机理,探讨多糖结构与其功能活性的构效关系,探究多糖生物合成的分子机制,构建多糖模型,寻找多糖生物合成中的关键途径,注重菌株的选育,开发多糖生产菌株的遗传改造,提高多糖的提取率,充分体现出发酵产品化价值和商业化价值。

总的来说,目前大多研究集中在发酵多糖的提取工艺,相关的生物合成代谢途径及多糖的作用机理方面还需继续深入研究。随着多糖发酵方法和相关科学技术的日益提升,相信在未来会开发出更多高效低耗的多糖提取工艺,奠定大规模生产多糖的基础,为多糖的开发和应用提供更广阔的前景。