microRNA-146a对牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激下淋巴细胞分泌细胞因子的调节作用

司雨婷 宋金花 方珍 韩晓哲 蒋少云

1.天津医科大学口腔医院牙周科，天津300070；2.北京大学深圳医院口腔医学中心牙周科，深圳518036；3.美国哈佛大学牙学院Forsyth研究所，美国剑桥02146

牙周炎是一种慢性感染性疾病，免疫炎症机制起了重要作用，其中包括淋巴细胞和细胞因子[1-2]。淋巴细胞既可以保护机体，也可以引起牙周组织的破坏[2-4]。microRNAs（miRs）约含有22个碱基，能通过结合靶基因的非转录区下调靶基因的表达，从而在炎症免疫中扮演关键的角色[5-7]。已有研究[8-9]表明miRs 在牙周炎中起着重要的作用。研究发现miR-128能调节牙周致病菌——牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）刺激下巨噬细胞的炎症反应[10]，miR-24 作为负调节因子参与被P. gingivalis脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活的巨噬细胞极化[11]。miR-146a缺乏导致T滤泡辅助细胞和生发中心B细胞的聚集，增强生发中心反应[12]。而且P. gingivalis能激活淋巴细胞引起牙周炎症[13-14]。前期研究[15-17]发现miR-146a 能抑制人牙龈成纤维细胞、牙周膜成纤维细胞和B 细胞分泌因子，如白细胞介素（interleukin，IL）1β、IL-6 和肿瘤坏死因子α，从而参与牙周炎的调节。虽然淋巴细胞在牙周炎免疫调节过程中起着重要的作用[2]，但miR-146a如何调节淋巴细胞尚不知。本研究目的是探索miR-146a对P. gingivalisLPS 刺激下淋巴细胞中细胞因子分泌的作用，为进一步阐明miR-146a 对牙周炎症的调节作用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

C57BL/6小鼠（8～10周，美国Jackson实验室）；改良伊格尔培养液（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、胎牛血清、青霉素、链霉素、左旋谷氨酸和两性霉素B、ACK 红细胞裂解液（Gibco 公司，美国），P.gingivalisLPS（Strain ATCC 33277，InvivoGen 公司，美国），miR-146a 模拟物、miR-146a 抑制剂或阴性RNA 对照、HiPerFect 转染试剂（Qiagen 公司，美国），PureLink®RNA Mini Kit 和SuperScript Ⅱ逆转录酶（Invitrogen 公司，美国），LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster（Roche 公司，德国），小鼠IL-1β、IL-6、IL-10 免疫酶联反应（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）MAXTM试剂盒（Biolegend 公司，美国），小鼠Trance 和骨保护素（osteoprotectin，OPG）ELISA DuoSet试剂盒（R&D system公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠淋巴细胞的提取和培养 根据美国Forsyth研究所的研究动物使用指南，处死C57BL/6小鼠（动物伦理编号：17-002），进行解剖。收集脾脏，在培养液（10%胎牛血清，100 units·mL-1青霉素，100 μg·mL-1链霉素，2 mmol·L-1左旋谷氨酸，0.25 μg·mL-1两性霉素B）中轻柔研磨。1 500 r·min-1离心5 min 收集细胞。用1 mL ACK 红细胞裂解液处理，去除红细胞。离心后悬浮于培养液，以每孔1×106个接种于96 孔板中。根据对细胞采用的刺激物（1 μg·mL-1P. gingivalisLPS、miR-146a 模拟物、miR-146a 抑制剂或阴性RNA 对照）不同，将实验分为6 组，分别为P. gingivalisLPS 未刺激组、P. gingivalisLPS 刺激组、P. gingivalisLPS/miR-146a 模拟物组、P. gingivalisLPS/模拟物阴性RNA 对 照 组、P. gingivalisLPS/miR-146a 抑 制 剂组、P.gingivalisLPS/抑制剂阴性RNA 对照组。处理细胞24 h 后收集培养的上清液和淋巴细胞进行检测。

1.2.2 细胞转染 以每孔1×106细胞接种于96孔板，37 ℃和5%CO2培养2 h。miR-146a 模拟物、抑制剂和阴性RNA 对照（终浓度10 nmol·L-1）与HiPerFect 转染试剂混合，室温中放置10 min，形成转染复合物。加入细胞，转染24 h。随后用1 μg·mL-1P. gingivalisLPS 刺激，24 h 后检测细胞因子的表达。

1.2.3 实时定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR） 用Pure-Link® RNA Mini Kit 提取总RNAs。SuperScript Ⅱ逆转录试剂盒和LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster 进行逆转录和qRT-PCR。IL-1β、IL-6、IL-10、OPG、细胞核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator NF-κB ligand，RANKL）、甘油乙酰三磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 和U6 small nuclear RNA 引物见表1[17-18]。GAPDH 和U6 分 别作为mRNA 和miRs内参。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.2.4 ELISA 反应 使用小鼠ELISA 试剂盒分析IL-1β、IL-6、IL-10、RNAKL、OPG 的分泌。收集的上清液加入抗体包被的96 孔板中孵育后用含0.1% Tween 的PBS 冲洗。与一抗和二抗反应后，加入底物，37 ℃孵育15～30 min。加入终止液后用微板读数仪（Bio-tek 公司，美国）在450 nm 波长检测光密度（optical density，OD）值。

1.3 统计分析

所有的实验至少重复2 次。数据以平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0 统计软件进行实验数据分析。两组间数据用双侧Student’st检验分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 P. gingivalis LPS 刺激淋巴细胞分泌炎症细胞因子

与P.gingivalisLPS未刺激组相比较，1 μg·mL-1P.gingivalisLPS 刺激后炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 和RANKL 的mRNA 水 平 升 高（P＜0.05），OPG 的mRNA 水平明显下降（表2）。ELISA 结果显示：1 μg·mL-1P. gingivalisLPS 刺激后炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 和RANKL 的分泌明显升高（P＜0.05），而OPG 的分泌无明显改变（P＞0.05）（表3）。这些数据提示P.gingivalisLPS 能影响淋巴细胞分泌细胞因子。

表2 P.gingivalis LPS对淋巴细胞中细胞因子mRNA水平的影响Tab 2 The effects of P. gingivalis LPS on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes

表3 P.gingivalis LPS对淋巴细胞分泌细胞因子的作用Tab 3 The effects of P. gingivalis LPS on the secretion of cytokines in lymphocytes

2.2 P. gingivalis LPS 刺激对淋巴细胞中miR-146a表达的影响

1 μg·mL-1P. gingivalisLPS 刺激后用qRT-PCR检测miR-146a 的表达情况。与非LPS 刺激组（0.95±0.19）相比较，1 μg·mL-1P.gingivalisLPS刺激后，miR-146a 的表达明显升高（1.76±0.73）（t=2.778，P=0.019 5），说明miR-146a可能参与P.gingivalisLPS刺激后淋巴细胞的炎症反应。

2.3 miR-146a 模拟物对P. gingivalis LPS 刺激下淋巴细胞分泌细胞因子的调节作用

miR-146a模拟物转染细胞后用1 μg·mL-1P.gingivalisLPS 刺激，24 h 后检测IL-1β、IL-6、IL-10、OPG和RANKL的表达。与P.gingivalisLPS/模拟物阴性RNA 对照组（1.81±0.56）相比，miR-146a 模拟物能明显升高miR-146a（10.65±0.82）的水平（t=15.42，P=0.000 1），miR-146a升高明显抑制IL-1β、IL-6和RANKL mRNA 的表达和分泌，但是促进IL-10 和OPG 的mRNA 表 达和 分 泌（P＜0.05）（表4、5）。

2.4 miR-146a 抑制物对P. gingivalis LPS 刺激下淋巴细胞分泌细胞因子的调节作用

miR-146a抑制物转染细胞后用1 μg·mL-1P.gingivalisLPS 刺激，检测IL-1β、IL-6、IL-10、OPG和RANKL 的表达。与P. gingivalisLPS/抑制剂阴性RNA 对照组（1.76±0.38）相比，miR-146a 抑制物能明显抑制细胞内miR-146a（0.36±0.09）的水平（t=6.209，P=0.003 4），miR-146a 水平降低后明显促进IL-1β、IL-6 和RANKL mRNA 表达和分泌，但是抑制IL-10 和OPG 的mRNA 表达和分泌（P＜0.05）（表6、7）。

表4 miR-146a 模拟物对P. gingivalis LPS 刺激的淋巴细胞中细胞因子mRNA水平的影响Tab 4 The effects of miR-146a mimics on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

表5 miR-146a 模拟物对P. gingivalis LPS 刺激的淋巴细胞分泌细胞因子的作用Tab 5 The effects of miR-146a mimics on the secretion of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

表6 miR-146a 抑制物对P. gingivalis LPS 刺激的淋巴细胞中细胞因子mRNA水平的影响Tab 6 The effects of miR-146a inhibitor on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

表7 miR-146a抑制物对P.gingivalis LPS刺激的淋巴细胞分泌细胞因子的作用Tab 7 The effects of miR-146a inhibitor on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

3 讨论

淋巴细胞在牙周炎的发病过程中起着重要作用[19]，参与牙周炎中牙龈炎症和牙槽骨的丧失[4]。miR-146已经被认为通过调节炎性因子的分泌在炎症中起着保护性作用[15-17]。

IL-1β 参与牙周炎的炎症反应。龈沟液和唾液中IL-1β 水平升高与牙周炎的进展密切相关[20-21]。IL-1β 具有双向功能：低浓度时（生理健康水平）促进成骨作用，但是高浓度时能抑制牙周膜干细胞的成骨过程，后者是修复牙槽骨的主要细胞[22]。同样，IL-1β 能促进巨噬细胞向M1 型极化，后者负责骨组织的吸收[23]。本研究发现：P. gingivalisLPS能促进淋巴细胞中IL-1β表达。IL-1β升高能阻碍牙周膜干细胞的成骨过程，加速骨吸收，不利于骨组织的修复和再生。miR-146a 升高能下降IL-1β，抑制miR-146a 能促进淋巴细胞中IL-1β 的水平，说明miR-146a通过调节IL-1β在淋巴细胞介导的骨修复和骨吸收中起着保护性的作用。

作为主要炎性因子之一的IL-6 在牙周炎中起着重要的作用。有研究显示：龈沟液中IL-6 浓度与牙周炎的临床指标呈正相关性[21,24]，而且参与局部B细胞反应[21]。P.gingivalisLPS能促进牙龈成纤维细胞和牙周膜成纤维细胞中IL-6 的分泌[15-16]。本研究证实P. gingivalisLPS 能明显提高淋巴细胞中IL-6 的水平，miR-146a 能降低淋巴细胞中IL-6 的产生，但抑制miR-146a 能促进淋巴细胞中IL-6 的水平，与其他的研究[17]相一致，这些结果说明miR-146a 通过降低淋巴细胞分泌IL-6，减少IL-6促进的牙周炎症。

IL-10 作为抗炎细胞因子，通过抑制破骨细胞引起的骨吸收，促进成骨细胞介导的骨形成来维持骨量[24-25]。T 细胞、B 细胞和其他的牙周细胞能分泌IL-10[10,26-27]。Zhang等[24]发现：慢性牙周炎和侵袭性牙周炎患者的龈沟中IL-10 水平明显升高。虽然研究[10]显示：抑制miR-146a 不改变人牙龈成纤维细胞分泌IL-10，而且抗IL-10 抗体能保护P.gingivalisLPS 注射的小鼠形成脓肿[27]。P. gingivalisLPS 能促进B 细胞分泌IL-10，miR-146a 抑制B细胞分泌IL-10，miR-146a 抑制物能促进B 细胞分泌IL-10[17]。但是，本研究发现miR-146a 模拟物能促进淋巴细胞分泌IL-10，且其抑制物阻止淋巴细胞分泌IL-10。从小鼠脾脏获得的淋巴细胞是T 细胞和B 细胞的混合细胞，细胞之间的交互作用对细胞因子的分泌起着重要的调节作用，从而导致miR-146a 对淋巴细胞产生的作用与单纯B 细胞不一致。

RANKL和OPG是调节骨吸收和骨形成的重要因子[28]。RANKL 升高促进骨吸收；反之，OPG 升高促进骨形成。淋巴细胞中T 细胞和B 细胞是RANKL 和OPG 重要的分泌细胞。本研究发现：P.gingivalisLPS 能抑制淋巴细胞分泌OPG，促进淋巴细胞分泌RANKL。但是，miR-146a能促进淋巴细胞OPG分泌，抑制淋巴细胞分泌RANKL，说明即使在炎症环境中miR-146a 也能促进骨形成，抑制骨吸收。而且以往的研究[29]显示：miR-146a 能促进P. gingivalisLPS 刺激下人牙周膜成纤维细胞的成骨分化，进一步说明了miR-146a 促进成骨的效应。

综上所述，miR-146a 能调节P. gingivalisLPS刺激下的淋巴细胞分泌与牙周炎症相关的炎性细胞因子和骨调节因子，从而调控骨改建过程，为牙周骨组织再生的方法提供新的思路。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。