紫外线照射对两种钛种植体表面形貌体外炎症反应的影响*

吕武龙 邓 炜 雷 雳 刘大勇 运新跃 李长义

种植体植入体内立刻会引起炎症反应［1］。巨噬细胞是首先到达种植体表面的一种细胞，是炎症反应的主要效应细胞。巨噬细胞通过吞噬细胞残片，分泌各种酶、细胞因子，影响伤口愈合和组织再生过程［2,3］。此外，巨噬细胞具有极大的可塑性，不同种植体表面形貌和/或化学性质可影响巨噬细胞的极化和细胞因子的分泌，最终影响种植体的早期骨结合过程［4,5］。紫外线照射是一种新型种植体表面改性技术，可提高钛种植体表面生物活性，促进种植体早期骨结合［6］。紫外线照射的抛光和TiO2纳米管形貌能否影响巨噬细胞炎症反应，少有报道。本项研究探讨紫外线照射的以上两种不同表面形貌对巨噬细胞功能的影响，为该技术的临床应用提供理论基础。

1.材料与方法

1.1 试件的制备 纯钛试件（直径为15mm，宝鸡钛业股份有限公司）经碳化硅砂纸抛光至600目备用，即抛光组。参考作者以往的研究［7,8］，采用阳极氧化法在抛光后的纯钛试件表面制备TiO2纳米管，0.5%氢氟酸溶液为电解液，铂片为阴极，实验采用20V恒电压，时间为40min，制备出TiO2纳米管，即纳米管组。为了使试件充分老化，参考Tsukimura等［9］的方法，所有抛光组和纳米管组试件经高压灭菌后避光保存8周。各组取一半试件置于紫外灯（30W，λ=253.7nm，飞利浦公司）下10cm处照射48h，照射后立即进行实验。经紫外线照射的抛光组和纳米管组试件标记为抛光+紫外线组和纳米管+紫外线组。

1.2 表面特征分析 采用场发射扫描电子显微镜（S-4800，日本日立）观察抛光组和纳米管组各1个试件的表面形貌。取以上4组试件各3个，室温下将1μL超纯水滴在试件表面，用接触角测定仪（JGW-360A，厦门崇达智能科技有限公司）测量接触角。

1.3 细胞培养 在5%CO2、37℃的条件下，用含青霉素、链霉素和10%胎牛血清的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）培养RAW264.7 小鼠巨噬细胞（北京协和细胞资源中心），每2-3 天传代1次。将四组试件放置于24 孔培养板中，以2×104个/孔的细胞密度将巨噬细胞接种在不同钛试件上，并设置空白对照组。

1.3.1 细胞黏附和增殖实验 培养4、24、72h后，用CCK-8细胞计数试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）检测各组试件巨噬细胞黏附和增殖情况，每组每个时间点3个试件。到达预定时间后，收集各组培养24和72h的细胞上清液用于后续细胞因子检测实验。到达预定时间后，漂洗试件，并转移到新的24孔培养板中，加1mL含CCK-8的高糖DMEM培养液继续培养1h。吸取200μL混合溶液至96孔培养板中，450nm处测定吸光度（OD值）。

1.3.2 细胞因子检测 取各组24和72h 的细胞上清液，按照液相芯片分析技术（Magnetic Luminex Assay）（LXSAMSM-05，R&D，美国）的说明，检测肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和巨噬细胞炎性 蛋 白1α（macrophage inflammatory protein1α，MIP-1α）的质量浓度。

1.3.3 细胞形态观察 每组巨噬细胞培养2h后，各取一个试件，经3%戊二醛溶液固定、梯度脱水、干燥后喷金，用扫描电镜观察细胞形态。

1.4 统计学方法 用SPSS 19.0 统计软件对各组试件表面接触角、相同时间点的细胞黏附和增殖OD 值、细胞因子的质量浓度分别进行单因素方差分析，并用SNK 法检验组间差别，检验水准设置为双侧α=0.05。

2.结果

2.1 抛光组和纳米管组试件表面形貌观察 较低的放大倍数下（500 倍），抛光组试件有明显的打磨痕迹（图1A），而纳米管组试件隐约可见打磨痕迹，表面有直径约为1-5μm 大小不等的凹坑（图1B）。较高的放大倍数下（100000 倍），抛光组试件仍然有明显划痕，无明显纳米结构（图1C），而纳米管组试件表面均匀分布直径约为80nm 的TiO2纳米管（图1D）。

图1 抛光组和纳米管组试件的表面形貌观察（A，B扫描电镜放大500倍；C，D扫描电镜放大100000倍）A，C：抛光组；B，D：纳米管组

2.2 各组试件表面接触角 抛光组、纳米管组、抛光+紫外线组和纳米管+紫外线组试件表面接触角分别为77.4°±4.6°、49.5°±6.9°、39.6°±3.8°和0.0°±0.0°，见图2。抛光+紫外线组和纳米管+紫外线组试件表面接触角明显小于抛光组和纳米管组（P＜0.05），且纳米管+紫外线组试件呈超亲水性，显著小于抛光+紫外线组（P＜0.05）。

图2 试件表面接触角PT：抛光组；NT：纳米管组；PT+UV：抛光+紫外线组；NT+UV：纳米管+紫外线组。a表示与抛光组相比P＜0.05；b表示与纳米管组相比P＜0.05；c表示与抛光+紫外线组相比P＜0.05

2.3 各组细胞黏附和增殖（见图3）培养4 和24h 时各组细胞吸光值相似，无统计学意义（P＞0.05）；培养72h 时，纳米管+紫外线组细胞增殖显著高于其他四组（P＜0.05）。

图3 各组细胞黏附和增殖情况PT：抛光组；NT：纳米管组；PT+UV：抛光+紫外线组；NT+UV：纳米管+紫外线组；Ctrl：空白对照组。a表示与抛光组相比P＜0.05；b表示与纳米管组相比P＜0.05；c表示与抛光+紫外线组相比P＜0.05；d表示与空白对照组相比P＜0.05

2.4 各组细胞因子的质量浓度（见表1）培养24h 时，抛光组TNF-α 质量浓度明显高于其他四组（P＜0.05），而各组VEGF 均很低，无显著性差异（P＞0.05）；培养72h时，抛光+紫外线组和纳米管+紫外线组TNF-α 和VEGF 质量浓度均分别显著小于抛光组和纳米管组（P＜0.05）。培养24h 时，抛光+紫外线组和纳米管+紫外线组MIP-1α 质量浓度均低于抛光组（P＜0.05）；培养72h 时抛光组MIP-1α质量浓度显著高于其他四组（P＜0.05）。

2.5 各组细胞形态观察（见图4）培养2h 后，抛光组巨噬细胞大多呈椭圆形，伸展充分，纳米管组更多细胞呈椭圆形，伸展更充分，长宽比更大，且有大片的板状伪足；抛光+紫外线组和纳米管+紫外线组巨噬细胞大都呈圆形，抛光+紫外线组细胞呈球状，而纳米管+紫外线组细胞更扁。

表1 各组试件细胞上清液中细胞因子质量浓度的比较（ng/L，Mean±SD）

图4 小鼠巨噬细胞在4组试件表面培养2h后的细胞形态（A，B，C，D扫描电镜放大500倍；E，F，G，H扫描电镜4000倍放大）A，E：抛光组；B，F：纳米管组；C，G：抛光+紫外线组；D，H：纳米管+紫外线组

3.讨论

种植体表面特征（如表面形貌、亲水性等）是影响种植体早期骨结合的重要因素［10，11］。种植体表面特征不仅影响骨髓间充质干细胞成骨分化，也影响巨噬细胞细胞因子的分泌、M1/M2极化的改变，从而最终影响种植体早期骨结合［4］。本项研究结果显示：紫外线照射的TiO2纳米管形貌可明显增加其表面亲水性和巨噬细胞增殖；此外，紫外线照射的两种种植体形貌均可降低巨噬细胞炎症因子的分泌。

本项研究中，充分老化的纳米管组试件的接触角明显小于抛光组，而纳米管+紫外线组试件的接触角是超亲水性的0°，显著小于抛光+紫外线组（P＜0.05）。该结果说明紫外线照射和TiO2纳米形貌具有协同作用，显著增加了该试件表面的亲水性。其原因可能有以下两点：第一，钛种植体在存储过程中会不断吸附碳氢化合物，降低了亲水性，从而影响种植体表面理化性质和生物活性［12，13］。TiO2纳米管能延缓钛表面碳氢化合物等污染物的沉积，因此，经过8周充分老化后，纳米管组试件的接触角也比抛光组试件小。第二，TiO2经紫外线照射后产生的光催化反应能有效清除其表面的碳氢化合物等污染物［12，14］。与抛光+紫外线组相比，纳米管+紫外线组试件表面的TiO2氧化层更厚，能产生更强的光催化反应，更有效清除碳氢化合物，从而增加了亲水性［12，15］。

种植体表面特征能影响细胞的黏附增殖、分化和局部细胞因子的分泌［16］。本项研究中，尽管各组试件表面巨噬细胞最初的黏附情况相似，但72h后纳米管+紫外线组细胞增殖最快。其原因可能是独特的TiO2纳米管形貌经紫外线照射后，能有效清除碳氢化合物等污染物，改变了试件表面的亲水性和化学性质［15］，从而影响了蛋白质的吸附、细胞的黏附增殖［2，5］。

尽管抛光组和抛光+紫外线组的细胞黏附增殖没有差异，但是抛光+紫外线组巨噬细胞分泌的炎症因子比抛光组少，甚至比纳米管组少，说明紫外线照射的两种形貌表面亲水性和化学性质的变化均有利于减少巨噬细胞炎症细胞因子的分泌。巨噬细胞具有极大的可塑性，不同种植体表面形貌和/或化学性质产生的不同微环境能改变其表型和功能［16，17］。本项研究中，紫外线照射的两种形貌均能减少巨噬细胞分泌TNF-α、MIP-1α和VEFG。研究显示，亲水性形貌可减少巨噬细胞炎症细胞因子的分泌，与本项研究结果一致［2，5，18，19］。通常认为，最初的炎症反应是成功骨结合的必要条件，而持续过度的炎症反应则不利于骨结合形成。如短暂、低水平的TNF-α可促进骨髓间充质干细胞的归募和成骨分化，而持续高水平的TNF-α对骨愈合有不利影响［20］。MIP-1α具有单核细胞趋化作用，能募集淋巴细胞和单核细胞到种植部位，从而促进了炎症反应［20］。VEGF的分泌是组织修复过程中血管形成的必要条件，而Spiller等发现，主要是M1型巨噬细胞而非M2型巨噬细胞分泌VEGF［21］。本项研究结果提示紫外线照射的两种形貌均能减少巨噬细胞炎症反应，可能改变了巨噬细胞极化，这可能是紫外线照射能促进种植体早期骨结合的部分原因。

本项研究结果显示，纳米管+紫外线组和抛光+紫外线组试件表面的巨噬细胞最初的形态呈圆形，与未照射组巨噬细胞形态有很大差异。这与紫外线照射改变了两种形貌试件表面亲水性和化学性质有关。作者在实验时注意到，将细胞悬液接种到纳米管+紫外线组和抛光+紫外线组试件表面时，细胞悬液迅速向四周铺展。紫外线照射导致的试件各向同性可能也是巨噬细胞向四周铺展，呈圆形的原因。研究发现细胞形态可调控巨噬细胞表型和功能，导致分泌的细胞因子有差异［22］。而紫外线照射钛种植体表面导致巨噬细胞功能的改变，其分子机制还有待于进一步研究。

4.结论

紫外线照射是一种简单有效的种植体表面改性技术。紫外线照射能增加两种钛表面形貌尤其是TiO2纳米管形貌的亲水性。紫外线照射的TiO2纳米管形貌能促进巨噬细胞增殖；紫外线照射的种植体表面形貌能减轻炎症反应。