Urantide对动脉粥样硬化大鼠脂肪肝组织中STAT3磷酸化的影响

崔海鹏，林映雪，王怡宁，王 途，李 英，赵 娟*

1承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000；2承德医学院附属医院药学部，河北 承德 067000

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种血脂异常及血管壁成分改变的慢性炎症病变［1］，其脂质代谢紊乱累及肝脏造成脂肪变性，近年来广受关注［2］。尾加压素Ⅱ（urotensin Ⅱ，UⅡ）是由11 个氨基酸残基组成的生长抑素样神经环肽，参与调节心血管、免疫、消化、泌尿等系统疾病的发生发展［3］。UⅡ主要通过与其特异性G蛋白偶联受体UT结合构成UⅡ/UT系统在多器官中发挥生物学作用［4］。有研究已证实，UⅡ/UT系统与肝内炎症损伤存在密切联系［5-6］。本课题组前期研究发现，UⅡ/UT系统可通过C反应蛋白（C⁃reactive protein，CRP）、单核趋化蛋白⁃1（mono⁃cyte chemotactic protein⁃1，MCP⁃1）以及白细胞介素6（interleukin⁃6，IL⁃6）参与AS大鼠体内炎症反应的发生［7-8］，同时诱导AS大鼠肝损伤，发生脂肪变性［9］，其具体调控机制尚有待阐明。近年研究发现，信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）可介导机体的炎症反应和细胞增殖诱导AS 的发生［10］。此外，STAT3 信号通路在非酒精性脂肪肝的发生发展过程中发挥关键作用［11-12］。为进一步探究AS大鼠脂肪肝中UⅡ/UT系统与STAT3之间的关系，本研究采用UⅡ受体拮抗剂Urantide阻断UⅡ/UT信号通路，观察了AS大鼠肝脏中STAT3的表达水平，初步探讨了UⅡ/UT系统对STAT3的作用机制，借以深入阐明UⅡ/UT系统对AS大鼠造成肝脂肪变性的反应机制。

1 材料和方法

1.1 材料

3 周龄雄性SPF 级Wistar 大鼠30 只，体重180～200 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（京）⁃2016⁃0011。Urantide（苏州强耀生物公司）；维生素D3（VD3，哈尔滨市华晟科技动物药品厂）；胆固醇、胆酸钠（Sigma公司，美国）；丙硫氧嘧啶片（上海朝晖药业有限公司）；兔抗大鼠p⁃STAT3抗体（CST公司，美国）；兔抗大鼠β⁃actin 抗体、HRP标记山羊抗兔二抗（Bioworld公司，美国）；TRIzol裂解液、RIPA蛋白裂解液、Brad⁃ford 组织蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TIAN⁃Script cDNA 第一链合成试剂盒、SuperReal PreMix SYBR Green 试剂盒、DAPI 染液、FITC 标记二抗（北京天根生化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理

30 只雄性Wistar 大鼠适应性饲养1 周［恒定温度（22±2）℃，相对湿度（50±10）%，正常摄食及饮水］，按照随机数字表随机分成3组（每组10只）：正常组、AS 组、Urantide 组。根据参考文献方法制备AS 大鼠模型［13］：AS 组、Urantide 组饲以特制高脂饲料（基础饲料80.8%，胆固醇3.5%，胆酸钠0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，猪油10%，白糖5%），并连续3 d 给予每只大鼠腹腔注射VD3150 μg/（kg·d）。于第4周，随机选取1只模型大鼠，进行血脂指标检测及病理学检测，以判断造模是否成功。模型复制成功后，Uran⁃tide 组尾静脉注射Urantide 30 μg/（kg·d），正常组和AS 组尾静脉注射等体积生理盐水，连续给药2 周。大鼠禁食12 h后取材。分别称取体重及肝重，计算肝系数（肝系数=肝重/体重×100%）。胸主动脉取血，全自动生化分析仪检测大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）的含量。本研究所有大鼠实验均严格遵循动物实验“3R”原则，按照中华人民共和国国家标准《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T 27416⁃2014）执行。

1.2.2 HE染色法

将大鼠胸主动脉、肝组织于4%多聚甲醛固定后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋后制备石蜡切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，常规HE染色，光镜下观察各组大鼠的病理学变化。

1.2.3 RT⁃qPCR检测

TRIzol 法提取肝组织总RNA，紫外分光光度计进行定量，TIANScript cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA，SuperReal PreMix SYBR Green 试剂盒分别检测STAT3、β⁃actin mRNA的CT值，基因检测引物序列见表1，扩增条件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃34 s，40 个循环；做熔解曲线。以STAT3 CT值与β⁃actinmRNA CT值的 差 值为ΔCT，采用2-ΔCT法计算各组mRNA的相对表达量。以上操作均按照试剂盒说明书进行操作。

表1 RT⁃qPCR的引物序列Table 1 The sequences of the primers for RT⁃qPCR

1.2.4 免疫印迹检测

采用RIPA 裂解液及匀浆仪提取肝组织的总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。45 μg蛋白上样于SDS⁃PAGE分离、转膜和5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，一抗p⁃STAT3（1∶800）、STAT3（1∶1 000）、β⁃actin（1∶10 000）于4 ℃摇床孵育过夜；洗膜后，加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，洗膜后用超敏ECL 化学发光试剂盒显影。Image J 软件测定蛋白条带灰度值，计算蛋白相对表达水平。

1.2.5 组织免疫荧光法检测

取制备好的肝组织石蜡切片样本，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，抗原修复，10%山羊血清封闭，一抗p⁃STAT3（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；洗片后，暗室中滴加FITC 标记二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h，弃去二抗，加入DAPI 染液，孵育45 min，洗片，防荧光淬灭剂封片后于荧光显微镜下观察。每组选3张飞片，每张飞片选取3 个不同视野进行拍照。Image⁃Pro Plus 6.0软件计算免疫荧光阳性细胞的平均光密度值，取平均值作统计学分析。

1.3 统计学处理

实验结果数据采用SPSS 21.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，均符合正态分布，采用单因素方差分析进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠胸主动脉及肝组织病理特征

如图1 所示，正常组胸主动脉血管内皮细胞排列整齐，中膜弹力纤维层结构完整清晰，血管平滑肌细胞整齐排列，内膜、中膜、外膜分界清晰完整；AS 组血管内皮细胞显著损伤，出现钙化，中膜弹力纤维断裂，呈现典型的AS 病理特征；Urantide 组血管内皮细胞损伤恢复明显，钙化显著消失，中膜平滑肌细胞及弹力纤维恢复尚可。相应地，正常组肝细胞形态结构正常，肝小叶结构，正常肝索排列均匀规则；AS组肝细胞明显肿胀变形，肝索排列紊乱，肝小叶界限不清晰，细胞质中出现大量空泡样脂滴，部分细胞核偏向细胞一侧，为典型的肝细胞脂肪变性；Urantide组肝细胞形态明显恢复正常，肝索排列尚可，肝小叶结构形态基本趋于正常组。这提示VD3联合特制高脂饲料可以成功诱导大鼠AS 和脂肪肝发生，而且Urantide可有效减轻AS病变及肝脂肪变性。

2.2 大鼠肝系数和ALT、AST水平

如图2 所示，与正常组相比，AS 组大鼠肝系数显著升高（P＜0.05）；Urantide组大鼠肝系数较AS组显著降低（P＜0.05），较正常组显著升高（P＜0.05）。相应的，与正常组相比，AS 组大鼠血清中ALT、AST水平显著升高（P＜0.05），Urantide 组血清中ALT、AST较AS组显著降低（P＜0.05），较正常组无显著差异（P＞0.05）。这提示AS组大鼠肝脏发生了严重的肝实质性损伤和炎症反应，而Urantide 可有效保护肝脏。

图1 各组大鼠胸主动脉及肝组织病理变化（HE染色，×400，标尺=20 μm）Figure 1 Morphological characters of thoracic aorta and liver tissues in rats of each group（HE staining，×400，scale bar=20 μm）

2.3 大鼠肝组织中STAT3 mRNA的表达水平

如图3所示，RT⁃qPCR检测结果显示，各组间大鼠肝组织中STAT3 mRNA 的表达水平无显著变化（P＞0.05，n=3）。提示VD3联合特制高脂饲料处理以及Urantide对大鼠肝组织中STAT3的转录水平均没有影响。

2.4 大鼠肝组织中STAT3、p⁃STAT3蛋白表达水平

图2 各组大鼠肝系数和ALT、AST水平Figure 2 Liver index and the levels of ALT，AST in rats of each group

图3 各组大鼠肝组织中STAT3 mRNA表达水平Figure 3 The levels of STAT3 mRNA expression in rat liver tissue of each group

如图4所示，免疫印迹检测结果显示，与正常组相比，AS组大鼠肝组织中p⁃STAT3蛋白表达显著升高（P＜0.05），STAT3 蛋白表达无显著差异（P＞0.05）；与AS 组相比，Urantide 组大鼠肝组织p⁃STAT3蛋白表达显著降低（P＜0.05），STAT3蛋白表达无显著变化（P＞0.05）。这提示VD3联合特制高脂饲料处理可显著活化大鼠肝组织中p⁃STAT3的表达，Urantide 可抑制p⁃STAT3 的表达水平，而对大鼠肝组织中STAT3的蛋白表达水平没有影响。

2.5 免疫荧光检测大鼠肝细胞中p⁃STAT3 的表达水平

如图5所示，免疫荧光结果显示，与正常组大鼠肝细胞中p⁃STAT3阳性染色荧光强度（5.06±1.01）相比，AS组荧光强度（1 504.78±241.19）显著增加（P＜0.05）。与AS 组相比，Urantide 组荧光强度（159.90±22.69）显著降低（P＜0.05）。

3 讨论

图4 各组大鼠肝组织中p⁃STAT3、STAT3水平Figure 4 The levels of p⁃STAT3 and STAT3 in rat liver tissue of each group

图5 各组大鼠肝细胞中p⁃STAT3水平（×400，标尺=20 μm）Figure 5 The levels of p⁃STAT3 in rat hepatocytes of each group（×400，scale bar=20 μm）

肝脏被视为脂质代谢的重要场所，不但其病变导致的脂质代谢紊乱是脂肪肝的发病基础，而且其诱导的高脂蛋白血症是AS 发生的最基本的危险因素［14］。随着生活水平的不断提高，高脂饮食逐渐成为危害人类健康的关键因素，近年来非酒精性脂肪肝的发病率呈明显上升趋势［15］。本课题组在前期体内研究中发现，用高脂饮食联合注射VD3的方法复制的AS 大鼠不但发生典型的AS 病变，而且均伴有明显的脂肪肝［9］；进一步研究发现，AS 大鼠血清中ALT、AST 水平显著升高，提示AS 大鼠肝脏出现严重的肝功能障碍及急性炎症损伤反应；与此同时肝内UⅡ/UT系统被激活，采用UⅡ受体拮抗剂Ura⁃ntide 对AS 大鼠进行治疗后，肝内UⅡ/UT 表达水平被显著抑制，同时肝脏肝功能明显恢复［16-17］。有研究表明，UⅡ/UT系统可诱导小鼠肝脏“内皮炎症”，在急性肝衰竭中发挥关键作用［18］。这提示，UⅡ/UT系统诱导的炎症反应可能介导了AS 大鼠脂肪肝的发生，其在肝脏中激活可能是肝脏损伤的主导因素。

本研究发现，AS大鼠脂肪肝组织中STAT3的基因和蛋白的表达水平较正常大鼠均无显著变化，而p⁃STAT3蛋白表达显著升高。STAT3是信号转导与转录激活蛋白家族成员，可被受体相关激酶磷酸化，然后形成同源二聚体或异源二聚体易位入核，作为转录激活因子介导多种基因的表达。STAT3参与调节多器官的病理生理过程，在细胞增殖、血管生成、癌症、脂质合成、细胞免疫等过程中发挥关键作用［19］。大量研究发现，STAT3 信号通路可引起组织细胞的炎症反应和细胞增殖，诱导AS［10，20-21］、非酒精性脂肪肝［11-12］等疾病的发生，其蛋白及磷酸化水平表达升高。由此，笔者推测AS 大鼠肝组织中p⁃STAT3蛋白表达水平升高可能与肝组织炎症反应相关，UⅡ/UT系统可能通过激活STAT3信号蛋白促进炎症因子表达诱导脂肪肝的发生发展。

为验证以上推论，本研究采用Urantide 阻断UⅡ/UT系统。实验结果发现，Urantide显著抑制了p⁃STAT3 的表达水平，而对STAT3 的基因表达和蛋白稳定性没有显著影响。这提示AS 大鼠肝内STAT3信号通路经UⅡ/UT系统活化，诱导肝脏发生炎症反应损伤肝细胞，促进脂肪肝的发生发展。同时Uran⁃tide 可通过抑制STAT3 介导的炎症反应，使大鼠肝脏的脂质代谢功能得以恢复，进而延缓脂肪肝的进一步发展。进一步的免疫荧光实验也证实了这一推论，Urantide可显著降低大鼠肝细胞中p⁃STAT3水平，抑制STAT3的活化水平。

综上所述，UⅡ受体拮抗剂Urantide可通过抑制STAT3介导的炎症反应，减轻肝细胞的损伤，进而缓解AS大鼠的肝脂肪变性。而炎症反应中UⅡ/UT系统激活STAT3 信号通路的具体分子作用机制仍需进一步研究。总之，本研究结果进一步表明，Uran⁃tide在治疗AS的同时，还可通过阻断STAT3这一信号途径来治疗脂肪肝。