2个北美冬青新品种组培快繁高效再生技术体系的建立

刘 瑞 张嘉仪 葛超奇 谢露露 陈 颖* 张 粲 陈 茜

（1. 南京林业大学南方现代林业协同创新中心，南京 210037；2. 生物与环境学院，南京 210037；3. 南京工业大学2011学院，南京 211816）

北美冬青（Ilex verticillata L.）又称落叶型冬青，轮生冬青，是生长于美国东北部的优良观果树种［1～2］。作为一种景观型树种其最大的优点是冬季落叶后红色或黄色果实挂满枝头，十分喜庆，果实可持续到次年4月份而不落，切枝瓶插寿命可达2 个月之久，在园林绿化、切枝、家庭装饰、会议展览等具有重要的用途。近几年国内学者引进的品种有12 种之多［3］，但流通于市场的主要有Ilex ver⁃ticillata‘Oosterwijk’，Ilex verticillata‘A.Gray’等品种，远远不能满足市场的需求。扦插繁殖成本低、省时省力，但它需要大量的现有苗木才能满足插穗的要求，对于新引进的数量较少的新品种，组织培养技术是唯一能利用较少的植物材料不断地扩大繁殖来快速获得大量苗木的方法，同时能够保持母本的优良性状。陈茜等［4］对“奥斯特”品种的雌、雄株嫩枝进行了组织培养技术的摸索，张俊林等［5］与李永欣等［6］也对“奥斯特”和Ilex verticillata‘A.Gray’品种进行了研究。但这些品种完整的、快速的再生体系还没有完全建立，其他品种如“Red Sprite”，“Winter Gold”的组培快繁研究尚未见报道。

为了扩大引种北美冬青新品种的繁殖系数，满足市场对苗木的需求，本研究对新引进的北美冬青2 个品种“Red Sprite”，“Winter Gold”进行了组织培养技术研究（前者果实红色，后者果实为黄色），建立了2个品种的高效增殖、高效再生技术体系，突破了北美冬青组培苗生根率低、移栽成活难的技术瓶颈，为北美冬青苗木的推广及新品种培育奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

北美冬青（Ilex verticillata）品种“Red Sprite”，“Winter Gold”，2 个新品种2 年生扦插苗2017 年由美国引进，苗木培养在南京林业大学在气候室中，待苗木抽出新梢后，剪取幼嫩枝条5.0～6.0 cm进行组织培养。

1.2 外植体消毒和茎段腋芽诱导

将新采幼嫩枝条洗去表面污渍后去叶，在超净台上将嫩梢浸入70%乙醇溶液中30 s，去乙醇，用无菌水冲洗2～3 次，再将材料放入0.3% KMnO4溶液中进行二次消毒，期间不断摇动或搅拌，20 min后用无菌水清洗4～5次，用无菌滤纸吸干水分，然后剪取1.0～2.0 cm的带芽嫩茎接种在添加不同组合6-苄氨基腺嘌呤（6-BA 0.5、1.0 mg·L-1）、萘乙酸（NAA 0.2、0.5 mg·L-1）和吲哚丁酸（IBA 0.2、0.5 mg·L-1）的MS 培养基上，进行腋芽的诱导，共8个处理。每个大试管接种1 个外植体，每个处理20 管，3 次重复，培养25 d 后，统计长度大于5 mm的萌发新梢数，计算腋芽的诱导率。

1.3 丛生芽的高效增殖培养及壮苗培养

待诱导出的腋芽长至1.0～1.5 cm 时进行增殖培养，将萌发的新梢剪下接种到丛芽增殖培养基中。以MS 为基本培养基，添加6-BA、NAA 浓度分别采用0.1、0.5 和1.0 mg·L-1，CPUU（氯吡苯脲）浓度采用0、0.5 和1.0 mg·L-1进行L9（33）正交组合，共9 个处理（见表1）；每个处理6 瓶，每瓶3 个腋芽，3次重复。培养25 d 后继代一次，再培养25 d 后统计长度大于5 mm丛生芽的数量，计算增殖系数。

表1 北美冬青品种芽增殖的3种调节剂正交组合表Table 1 Experiment factors and level on plant growth regulation for adventitious bud proliferation of two I.verticillata L. varieties

将丛生芽切割成3～4 cm3的组织块接种于壮苗培养基中。壮苗培养基为以MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1赤霉素（GA）为基础，添加0.05、0.25、0.50 和1.00 mg·L-1的噻苯隆（thifenolone，TDZ），每个处理6 瓶，每瓶接种一个芽丛块，3 次重复。培养25 d 后，统计芽苗生长状况和增殖系数。

1.4 组培苗的生根诱导

待上述壮苗培养基的丛芽长至3.0～4.0 cm 时进行生根诱导培养。以1/2 MS 为基本培养基，添加不同浓度的IBA 和NAA（0.1、0.4 和1.0 mg·L-1）和1.0 g·L-1的活性炭（activated carbon，AC），每个处理6 瓶，每瓶8 株组培苗。培养35 d 后，统计生根率及根数。

上述所有培养基中均添加30 g·L-1蔗糖，6.5 g·L-1琼脂，pH 调至5.8。培养室温度为（25±2）℃，光照强度55µmol·m-2·s-1，光照时间14 h·d-1。

1.5 移栽与培养

当上述生根培养基中组培苗长至6.0～7.0 cm左右，不定根长约为5.0 cm 以上时，进行移栽。将封口膜或瓶盖打开，用镊子将生根苗轻轻从培养瓶中取出，洗去根部残余的培养基，将组培苗根部浸入0.1%多菌灵溶液中3 min，然后移栽至盛有不同配比栽培基质的无纺布袋中，用陈颖等［7］发明的组培苗移植栽装置培育20～30 d，期间每7 d 补充一次水分，20～30 d 后转入室外自然条件下培养。每个处理35 株，3 次重复，于第30 d 时统计小苗成活情况。

1.6 组培苗的田间培养

待成活后的组培苗生长至10 cm以上时，将其移至到室外的扦插池中培养，正常管理。

1.7 数据处理与统计

腋芽诱导率、增殖系数的计算陈茜等［4］，用Excel 2016 进行数据处理，SPSS 20.0 进行方差分析，表中不同小写字母表示在P＜0.05 水平上差异显著。

2 结果与分析

2.1 两个新品种北美冬青茎段腋芽的诱导

由表2可看出，不同生长调节剂组合对茎段腋芽的诱导效果不同。品种“Red Sprite”在MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA 的培养基中萌发的新梢长度最长为1.45 cm，诱导率为91.7%，而在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 的 培 养 基 中，“Red Sprite”的腋芽诱导率为100%，新梢长度为1.34 cm。从表2 中还可以看出，3 种调剂剂中1.0 mg·L-16-BA 对“Red Sprite”品种腋芽的诱导影响更大一些，此时NAA 或IBA 浓度在0～0.5 mg·L-1时其腋芽诱导率都可达到91.7%～100%；而6-BA在0.5 mg·L-1时，除添加0.2 mg·L-1也可达到100%外，其他NAA 和IBA 的组合腋芽诱导率较低，其中在NAA 0.5 mg·L-1时腋芽诱导率最低（66.7%，4 号培养基）。

表2 不同6-BA，NAA，IBA组合对落叶型冬青腋芽诱导的影响（MS为基本培养基）Table 2 Effects of different combinations of 6-BA，NAA and IBA on shoots induction of two I. verticillata L. varieties（MS as basic medium）

对于品种“Winter Gold”来说，6-BA 与IBA 组合不及6-BA与NAA的组合效果好，在6-BA与IBA组合中，只有14 号培养基腋芽诱导率达到了100%，其他的3 个培养基诱导率都在83.0%～85.1%；而6-BA 与NAA 组合中，4 个培养基其腋芽的诱导率都达到了100%（P＜0.05）。最适培养基是MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，新梢长度最长，达1.7 cm，诱导率可达100.0%（见图1E）。

2.2 两个北美冬青新品种芽的高效增殖培养

从表3中可以看出，两个北美冬青品种的腋芽在增殖培养基上继代后50 d后，3种调节剂对品种“Red Sprite”芽的增殖系数和每瓶芽数产生不同的影响。方差分析表明，4号培养基的增殖系数和芽数最高，与其他培养基存在着显著的差异（P＜0.05），3 号，5 号，7 号，8 号培养基的增殖系数次之（4者之间差异不显著，P＞0.05），都在4.2～4.8；增殖系数最低的培养基是1号，只有2.7，显著地低于其他的培养基。极差分析表明，6-BA 水平在0.5 mg·L-1、NAA 在0.1 mg·L-1、CPPU 在1.0 mg·L-1分别优于其它2 个水平，3种调节剂中6-BA对品种“Red Sprite”芽增殖的影响最大（R=1.17），CPPU 次之，NAA 影响最小，0.5 和1.0 mg·L-1的CPPU 对增殖系数的影响没有显著性差异，因此，品种“Red Sprite”丛生芽的最佳培养基为MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1CPPU，增殖系数达5.7，丛生芽数每瓶最高达57.0个（见图1：B～C）。

表3 不同调节剂组合对2个北美冬青品种丛生芽增殖的影响Table 3 Effects of different regulator combinations on shoot proliferation of two I.verticillata L. varieties

不同组合的3 种调节剂对品种“Winter Gold”的丛芽增殖也产生不同的影响，方差分析表明13号培养基的增殖系数最高，达4.5（远低于“Red Sprite”品种），与其他处理存在着显著的差异（P＜0.05）；12 号，14 号，16 号培养基的增殖系数次之，在2.9～3.5 范围，10 号培养基的增殖系数最低，只有1.1，与其他培养基都存在着显著的差异（P＜0.05）。极差分析表明，同“Red Sprite”品种一样，6-BA 水平在0.5 mg·L-1、NAA 在0.1 mg·L-1、CPPU在1.0 mg·L-1，都分别优于其他2 个水平，3 种调节剂中CPPU 对品种“Winter Gold”丛芽的增殖影响最大（R=1.7），6-BA 次之，NAA 影响最小。从增殖系数和丛芽数来看，品种“Winter Gold”的丛芽增殖最佳培养基为MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1CPPU，芽数每瓶达到28.0 个，增殖系数4.5（见图1：F～G）。

2.3 TDZ对落叶型冬青壮苗培养的影响

培养基中添加CPPU 虽有利于丛生芽的增殖，但丛芽较细嫩不利于生根，因此在以上筛选出的最优增殖培养基MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA 的基础上，添加1.0 mg·L-1GA（赤霉素GA3）和不同浓度的TDZ 进行壮苗培养25 d 后，发现TDZ对2个品种组培芽苗的高度、生长状况及增殖系数都有不同的影响。表4 中，品种“Red Sprite”在添加1.0 mg·L-1TDZ 时既能增加繁殖系数，又能增强芽苗的长势，芽苗长得高而粗壮，最高达6.8 cm，增殖系数达4.6（见图1D）。而0.05 mg·L-1TDZ 对品种“Winter Gold”壮苗效果最好，芽苗最高为4.4 cm，增殖系数达3.1，与其他处理间存在显著差异（P＜0.05，见表4、图1H）。

表4 TDZ对2个北美品种芽苗增殖及生长的影响Table 4 Effects of TDZ on shoots proliferation and growth of two I.verticillata L. varieties

2.4 两个新品种冬青组培苗高效再生体系的建立

从表5中可以看出，单独添加0.4 mg·L-1NAA，品种“Red Sprite”的生根率只有25.0%。在0.4 mg·L-1NAA基础上，添加0.5～2.0 mg·L-1AC有利于“Red Sprite”芽苗的生根，生根率最高可达66.7%，但AC 浓度在2.0 mg·L-1时生根率下降（56.4%）。不同浓度IBA 添加1.0 mg·L-1AC 时，生根率只有16.7%～18.3%。而在NAA 和AC 共存下添加0.4～1.0 mg·L-1的IBA可显著地提高“Red Sprite”芽苗的生 根 率，其 中1/2MS+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1AC+1.0 mg·L-1IBA 生根率最高，根数也最多，但组培苗根较粗壮、脆弱易断，且苗高度也被抑制。而1/2MS+0.4 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1AC+0.4 mg·L-1IBA 培养基上的苗高达5.54 cm、根数达7.0、生根率达95%，应为“Red Sprite”的最佳培养基（见表5，图2A）。

表5 品种“Red Sprite”的不定根再生体系建立（1/2MS基本培养基）Table 5 Establishment of adventitious root regeneration system of“Red Sprite”variety（1/2 MS basic medium）

表6 品种“Winter Gold”的不定根再生体系建立（1/2MS基本培养基）Table 6 Establishment of adventitious root regeneration system for“Winter Gold”variety（1/2 MS basic medium）

表7 不同栽培基质对2个北美冬青品种组培苗移栽成活率的影响Table 7 Effects of different culture substrates on survival rates of plantlets of two I.verticillata L. varieties

同样，只有0.4 mg·L-1NAA 的存在下，品种“Winter Gold”的生根率也只有25%，在1.0 mg·L-1AC 存在下，分别添加0.1～1.0 mg·L-1的NAA和IBA 的情况下生根率提高，1.0 mg·L-1的NAA 和0.4 mg·L-1IBA 生根率提高到了69.2%和85.5%。而AC、NAA 和IBA 三者共存的情况下，品种“Winter Gold”芽苗的生根再次提高，最高可达到97%，即最佳培养基为1/2MS+0.4 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1AC+0.4 mg·L-1IBA，根数7.0，苗高5.0 cm；在其他不变的情况下NAA 降低到0.1 mg·L-1生根率达90%，根数5.5，苗高4.9 cm（见表6，图2D），但当NAA 与IBA 都升高至1.0 mg·L-1时，生根率又降低至67.0%。

2.5 两个北美冬青品种组培苗高效移栽体系的建立

待生根小苗根长在5.0 cm 以上，苗高在9.0～10.0 cm 时，将组培苗从培养基中取出移栽到不同比例基质的移栽装置中［7］，按照上述管理方法，移栽成活率大大提高。移栽成活率较高的栽培基质为泥炭土∶花园土∶珍珠岩=3∶1∶2 或泥炭土样∶珍珠岩=3∶2（体积比），“Red Sprite”成活率达92.3%～95.7%（见图2B），“Winter Gold”在88.2%～96.8%（见图2D，表7）。

2.6 组培苗的室外生长

在培养室生长至15 cm以上的组培苗，移至到室外的扦插池中培养，进行正常浇水施肥管理，2个月后苗木高度达20 cm，生长正常（见图2：C，F）。

3 讨论

如何通过激素调控植物细胞的命运，进行重编程进而发育成为一个独立的植株或器官，是建立植物高效再生技术的理论基础之上［8］。直接器官发生是指通过茎段顶芽或腋芽的萌发诱导丛生芽来实现快速繁殖的过程，具有遗传性状稳定、能够快速获得优良植株的优点［9］。从我们的研究结果来看，北美冬青腋芽诱导的丛生芽属于直接器官发生，这为保持北美冬青新品种的优良性状提供了保障。另外细胞分裂素（CTK）和生长素（IAA）的比值决定着不定芽的分化能力和繁殖速度［10］，CTK/IAA 比值高有利于芽的分化，比值低有利于根的分化，中等比值有利愈伤组织的分化［11］。在北美冬青的组织培养中，高比值的6-BA/NAA（2.0～5.0，3 号，7 号培养基）或6-BA/IBA 比值在2.0～2.5（1 号和6 号培养基）都有利于品种“Red Sprite”的腋芽的诱导，而比值的6-BA/NAA 为1.0或6-BA/IBA 为1.0 或5.0（如4 号培养基）时腋芽诱导率降低。这些结果与云南樱桃的腋芽诱导结果一致［12］。丛生芽的增殖除了与6-BA/NAA 的比值有关外，再次添加另外一种生长调节剂CPPU 后可更有效的提高品种“Red Sprite”和“Winter Gold”腋芽丛生芽的增殖系数。这与我们前文在“奥斯特”品种的效果一致［4］。CPPU 属苯基脲类化合物，其生理活性高于6-BA，而且CPPU 和6-BA 在促进芽增殖方面有共效作用［13～14］。

陈茜等［4］发现“奥斯特”品种的芽苗在生根诱导培养到第50 天后的生根率最高达到66.7%。张俊林等［5］在连续培养了90 d 的“奥斯特”品种组培苗中仍未见生根现象，直到继代14 代次后才有根的出现，说明北美冬青的生根条件还需进一步的优化。我们同样发现北美冬青组培苗的生根，除了与添加的调节剂有关外，还与前期丛生芽的继代次数关系密切，在将第一次诱导的有效丛生芽进行不定根诱导时，发现生根时间长（50 d），生根率较低，只有18%左右（资料未给出），但在不断地将丛生芽继代增殖后将有效芽（第三代）进行生根诱导时，生根率提高至25.0%（添加0.4 mg·L-1的NAA），分 别 添 加NAA 和IBA 后 生 根 率“Red Sprite”提高到33.3%，“Winter Gold”提高到48.3%以上，而在NAA 和IBA 共存情况下添加活性炭生根率分别提高到95.0%和96.7%，且根系生长旺盛，苗木长势好（见表5～6）。继代次数对生根率的影响在山杏、苹果的组织培养中也有类似的现象，山杏芽的增殖从初代培养到1 次、2 次继代培养后各类组培苗的丛生芽诱导率都逐渐增加［15］。丛生芽继代次数（第2～3 代后）促进芽苗生根的作用，可能与丛芽的返幼状态有关。研究表明不同部位的毛白杨经多次继代后有幼化的趋势［16］，白花泡桐经过3～10 次继代后可完全得到幼化［17］，裴东等［18］认为幼龄状态的林木具有良好的生根能力，因此我们认为北美冬青新品种“Red Sprite”和“Winter Gold”丛生芽经过多次继代后，通过生长调节剂的调控作用，使得诱导的从生芽逐步返回幼态，其生根能力得到提高，因而生根率增加。另外在生根培养基中添加活性炭有利于生根，如贯叶连翘［19］、江南越桔组茎段［20］的组培生根培养基中都添加了1.0～3.5 g·L-1AC，有的生根率达100%，与我们的结果相一致。活性炭促进芽生根的作用，可能是这些植物的生根需要黑暗的环境和吸收一些过高调节剂成分有关。而在楸树茎段腋芽再生过程中，活性炭有抑制根数的作用，可能是活性炭浓度过高（2.0～4.0 g·L-1）［21］或者植物本身的特性所致［22］。

组培苗移栽成活率是检验组织培养技术体系是否成熟的关键点，通过采用我们发明的移栽装置大大提高了组培苗的成活率。另外栽培基质的比例也影响着苗木的成活率和长势，蛭石∶珍珠岩∶园土=1∶1∶3 配比的基质上有利于狭叶黄芩组培苗的成活率［23］；金桂微繁苗配比为苗圃土∶珍珠岩∶腐殖土=2∶3∶7 的基质，成 活 率可达到82.2%［24］；花生壳∶石灰岩∶蛭石∶活苔藓=1∶1∶1∶2的基质铁皮石斛的移栽成活率达75%［25］。在我们的研究中4 种不同配比基质中如泥炭土∶花园土∶珍珠岩∶蛭石=4∶1∶2∶3，有蛭石存在的情况下，成活率最高在80%～83%，但去掉蛭石后，泥炭土∶花园土∶珍珠岩=3∶1∶2 或者泥炭土∶珍珠岩为3∶2时，可显著提高这2 个品种的成活率，都达到88%以上，其原因可能是本研究中蛭石的添加量过高减少了基质空隙度，透气性不强，使得成活率降低。

综上，本研究形成了一整套“Red Sprite”和“Winter Gold”2 个品种的高效腋芽、高效丛生芽、高效生根和高效移植的组织培养快速繁殖技术体系。腋芽诱导25 d，腋芽增殖25 d，壮苗培养25 d，生根诱导35 d，移栽成活20 d，即130 d内即可完成整个体系。经优化后将增殖（与壮苗合并）、生根到移栽成苗（省去炼苗过程）整个过程缩短到了80 d。“Red Sprite”品种丛生芽的最高增殖系数为5.7，生根率达最高达95.0%，移栽成活率达95.7%；“Winter Gold”品种丛生芽的增殖系数为4.5，生根率达97.0%，移栽成活率达96.8%。该体系有效地缩短了繁殖的时间，增加了苗木的繁殖率，保持了其优良的观赏特性，为北美冬青苗木的推广和观赏园、切枝园的建立提供了基础。