子宫肌瘤患者血清miR-21的表达及与ER、PR的相关性研究

李燕华 吴小芳 张利容 安银华 邓夏 刘玲玲 孙华

子宫肌瘤是由子宫平滑肌增生引起的良性肿瘤，是女性生殖器官常见疾病。子宫肌瘤多发于30～50岁女性，且发病率有逐年上升趋势，精神压力大、环境卫生差、内分泌失调、晚育、妊娠、生殖道炎症等均能影响子宫肌瘤发病[1]。有研究表明，子宫肌瘤是一种激素依赖性肿瘤，雌激素、孕激素均与子宫肌瘤发生发展有关[2]。Grings等[3]研究报道，雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)在子宫肌瘤组织中过表达，促进子宫平滑肌瘤生长。有研究发现，降低ER水平可减小子宫肌瘤体积，有效抑制子宫肌瘤进展[4]。Tsigkou等[5]研究证实，子宫肌瘤组织中孕激素受体(Progesterone Receptor，PR)表达水平明显高于正常子宫肌层组织，与患者年龄、肌瘤数量有关，PR信号可能有利于子宫肌瘤生长。PR拮抗剂可抑制子宫肌瘤增殖，可用于子宫肌瘤临床治疗[6]。有研究表明，miR-21在肝癌患者血清中高表达，与肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移及患者5年生存率有关[7]。Zhang等[8]研究发现，下调miR-21表达可抑制宫颈癌细胞增殖、促进凋亡，抑制肿瘤生长。然而miR-21在子宫肌瘤患者中作用尚未有研究，本研究通过检测子宫肌瘤患者血清中miR-21表达水平，分析其与ER、PR表达水平及临床病理特征关系，探究miR-21在子宫肌瘤中意义，为子宫肌瘤临床治疗提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2019年1月本院收治的子宫肌瘤患者118例，患者年龄29～61岁，平均(47.63±8.54)岁。入组患者按组织学分型分为：肌壁间肌瘤37例，浆膜下肌瘤42例，黏膜下肌瘤39例。另选择同期因子宫脱垂行子宫切除术患者118例作为正常子宫肌层组，年龄28～60岁，平均(47.02±8.31)岁。2组年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①经临床及病理切片诊断为子宫肌瘤且需行子宫肌瘤切除术者；② 3个月内未使用激素类药物；③患者及其家属知情并签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：①合并患有糖尿病、甲状腺功能异常类疾病者；②合并患有恶性肿瘤者；③患有严重精神疾病者。

1.3 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(货号：JL1256，德国Qiagen公司)、反转录试剂盒(货号：205311，德国Qiagen公司)、实时荧光定量(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)试剂盒(货号：208054，德国Qiagen公司)、兔抗人ER多克隆抗体(货号：ABP0086，Abbkine生物技术有限公司)、兔抗人PR多克隆抗体(货号：ABP55583，Abbkine生物技术有限公司)、羊抗兔IgG二抗(货号：QN2732-PWV，北京百奥莱博科技有限公司)、免疫组织化学染色试剂盒(货号：YDJ4123，上海羽朵生物科技有限公司)、qRT-PCR仪(型号：7500 Fast，美国ABI公司)、光学显微镜(型号：DCM8，德国徕卡公司)。

1.4 方法

1.4.1 样本采集:术前清晨7∶00～9∶00采集所有入组者空腹时外周静脉血，3 000 r/min离心20 min，取上清液分装于无菌EP管中，-20℃保存备用。术中分别收集子宫肌瘤患者子宫肌瘤组织及子宫脱垂患者正常子宫肌层组织，液氮迅速冷冻后，置于-80℃保存备用。

1.4.2 qRT-PCR检测血清中miR-21、ER mRNA、PR mRNA表达水平:使用试剂盒提取总RNA、反转录后得到cDNA，进行qRT-PCR。20 μl反应体系如下：SYBR Green PCR Mix 10 μl、ROX Dye 0.1 μl、上、下游引物各2 μl、cDNA 2 μl、RNase-free水3.9 μl。反应步骤如下：95℃ 2 min，1个循环；95℃ 5 s，60℃ 10 s，38个循环。采用2-ΔΔCT法计算miR-21、ER mRNA、PR mRNA相对表达量。见表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4.3 免疫组织化学染色检测组织中ER、PR蛋白水平:按照免疫组化染色试剂盒说明书步骤进行实验。最终切片在光学显微镜下进行观察，并选取400倍镜下5个视野进行ER、PR蛋白阳性细胞计数。细胞核中呈棕黄色或棕褐色为ER蛋白阳性细胞，细胞质中呈棕黄色或棕褐色为PR蛋白阳性细胞。染色结果评分标准：按照染色强度和阳性细胞所占百分比记分。①染色强度：无色为、淡黄色为、棕黄色、棕褐色分别记为0分、1分、2分、3分。②阳性细胞所占百分比：<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别记为0分、1分、2分、3分、4分。两者记分相乘，≤3分为阴性表达，>3分为阳性表达。

2 结果

2.1 2组miR-21、ER mRNA、PR mRNA表达水平比较 miR-21、ER mRNA、PR mRNA在子宫肌瘤组患者血清中表达水平均显著高于正常子宫肌层组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组miR-21表达水平比较

2.2 2组ER、PR蛋白表达水平比较 ER蛋白阳性表达主要定位于细胞核中，PR蛋白阳性表达主要定位于细胞质中。ER蛋白、PR蛋白在子宫肌瘤组织中阳性表达率均显著高于正常子宫肌层组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，图1。

表3 2组ER、PR蛋白表达水平比较 n=118，例

ER蛋白阳性表达 ER蛋白阴性表达 PR蛋白阳性表达 PR蛋白阴性表达

2.3 子宫肌瘤患者miR-21表达水平比较 ER阴性组miR-21表达水平显著低于ER阳性组(P<0.05)，PR阴性组miR-21表达水平显著低于PR阳性组(P<0.05)。见表4。

表4 不同ER、PR表达组子宫肌瘤患者miR-21水平比较

2.4 不同水平miR-21、ER、PR子宫肌瘤患者临床病理特征比较 子宫肌瘤患者血清miR-21及子宫肌瘤组织ER蛋白、PR蛋白表达水平均与年龄、肌瘤直径、组织学分型无关(P>0.05)，与肌瘤数目、阴道不规则出血、月经周期有关(P<0.05)。见表5。

表5 不同水平miR-21、ER、PR子宫肌瘤患者临床病理特征比较 例

2.5 子宫肌瘤患者血清miR-21与ER mRNA、PR mRNA相关性 子宫肌瘤患者血清miR-21表达水平与ER mRNA表达水平呈正相关(r=0.422，P=0.000)，与PR mRNA表达水平呈正相关(r=0.419，P=0.000)。见图2、3。

图2 子宫肌瘤患者血清miR-21与ER mRNA水平相关性

图3 子宫肌瘤患者血清miR-21与PR mRNA水平相关性

3 讨论

子宫肌瘤患者多无明显症状，但多数患者可能伴有白带异常、痛经、贫血、腹部包块、子宫出血等，影响患者日常生活质量。虽然子宫肌瘤为良性肿瘤，但也有恶变可能，需引起患者重视[9]。目前关于影响子宫肌瘤发生发展中相关因素尚不明确，探寻相关因子调控作用对控制子宫肌瘤病情发展，改善患者生活质量有一定意义。

人体内雌激素由人卵巢和胎盘分泌，能促进女性第二性征发育及性成熟，与人体生长、内分泌及心血管代谢密切相关。雌激素分泌持续易在短时间内引起子宫内膜增生过多，进而引发子宫肌瘤。人体内孕激素由卵巢黄体细胞分泌，能抑制排卵、促进乳腺腺泡生长、松弛血管及促进子宫内膜增生，与雌激素作用相似，二者存在相互作用[10]。雌激素、孕激素均可分别与ER、PR特异性结合，发挥其生物学效应。Leão等[11]研究发现，与萎缩的子宫内膜相比，子宫内膜息肉中ER、PR表达水平增加。Mäkinen等[12]研究表明，子宫肌瘤组织中ER、PR呈阳性，ER、PR水平能在一定程度上为临床靶向治疗和病情改善提供一定依据。本研究结果显示，与正常子宫肌层组织相比，ER蛋白、PR蛋白在子宫肌瘤组织中阳性表达率均显著升高，与Mäkinen等[12]研究结果一致，提示ER、PR表达水平变化与子宫肌瘤发生有关。研究报道，ER、PR表达与子宫体积变化有关[13]。ER蛋白在子宫内膜增生期表达明显高于分泌期[14]。Mohammed等[15]研究发现，ER在可通过靶向PR基因，影响乳腺癌临床病理特征。本研究发现，与肌瘤数目、阴道不规则出血、月经周期有关，提示ER、PR与子宫肌瘤进展有关，ER、PR可能通过促进细胞增殖和生长，引起子宫内膜增生，影响子宫肌瘤增多及体积增大，促进子宫肌瘤发展。

有研究表明，子宫内膜癌患者血清中miR-21表达水平显著高于正常子宫内膜组织，与浸润深度、病灶大小有关[16]。本研究结果显示，miR-21在子宫肌瘤患者血清中表达水平显著高于正常子宫肌层组，与蔡如玉等[16]在子宫内膜癌中研究结果相似，提示miR-21可能与子宫肌瘤发生发展有关。有研究报道，miR-21可促进气道平滑肌细胞增殖和迁移[17]。Wang等[18]研究发现，miR-21上调可促进子宫内膜间充质干细胞增殖。本研究结果显示，子宫肌瘤患者血清中miR-21表达水平与肌瘤数目、阴道不规则出血、月经周期有关，提示子宫肌瘤中miR-21表达影响子宫肌瘤进展。

有研究表明，乳腺癌组织中miR-181a、miR-23、miR-26表达水平均显著低表达，PR阳性患者三者表达水平均显著低于PR阴性患者，过表达三种miRNA可下调PR mRNA表达[19]。张广平等[20]研究报道，miR-200a可通过靶向ER抑制子宫内膜癌细胞生长。以上研究提示miRNA可通过靶向ER、PR促进肿瘤细胞生长增殖，影响肿瘤进程。Petrovic等[21]研究发现，ER、PR阳性乳腺癌患者miR-21水平高于ER、PR阴性乳腺癌患者，患者miR-21水平与ER、PR水平呈正相关。本研究结果显示，子宫肌瘤患者血清中，与ER、PR阴性组相比，ER、PR阳性组患者miR-21表达水平显著升高，与Petrovic等在乳腺癌中研究结果一致，提示miR-21与ER、PR可能存在相互作用机制，共同参与子宫肌瘤发生发展。但具体作用机制尚需进一步深入研究。

综上所述，子宫肌瘤患者血清中miR-21、ER、PR表达水平均显著升高，三者表达水平均与与肌瘤数目、阴道不规则出血、月经周期有关。miR-21表达水平均与ER、PR水平呈正相关，三者间可能相互作用，共同影响子宫肌瘤发生发展。但由于本研究方法较为基础，样本量较少，三者机体协同表达机制还需大量样本和实验深入研究。