通用流感疫苗的研究进展

江湖大川，金鹏飞综述，朱凤才审校

1.江苏省疾病预防控制中心疫苗临床评价所，江苏 南京 210009；2.江苏省疾病预防控制中心国家卫生健康委员会肠道病原微生物重点实验室南京医科大学全球健康中心，江苏 南京 210009

流行性感冒（简称流感）给全球公共卫生造成严重疾病负担，接种疫苗是预防流感的最佳手段。由于流感病毒重要蛋白突变导致的抗原漂移，使该病毒能逃避目前疫苗引起的特异性免疫，因此，季节性流感疫苗的保护型别有限，需每年接种不断更新的疫苗［1］。目前已上市季节性流感疫苗的保护效果仅有40%～60%［2］。开发一种通用疫苗，可预防多种流感病毒株及其引起的全球大流行是最终的目标。近两年，美国众议员和比尔及梅琳达·盖茨基金会提出要加大对通用流感疫苗研发的财政支持和基金投入。

通用流感疫苗是一种覆盖所有甲型及乙型流感病毒株，且不依赖于抗原漂移或血凝素（hemagglutinin，HA）／神经氨酸酶（neuraminidase，NA）亚型的疫苗，包括目前已认知的18种HA、11种NA亚型的甲型、Yamagata／Victoria系乙型流感病毒谱系及未来可能发生漂移的病毒株［3］。美国国家过敏和传染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases，NIAID）于2017年6月在题为“研制通用流感疫苗的途径”的研讨会中，提出通用流感疫苗的合理目标是为全人群罹患由甲型流感病毒组1（H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11 ～ H13、H16 及 H17）、组 2（H3、H4、H7、H10、H14 及 H15）引起的有症状流感提供至少12个月且≥75%的保护效力［4］。基于近年来在病毒免疫学、单克隆抗体、结构生物学及蛋白质工程学等科学领域的研究，开发一种广谱、提供持续免疫并针对多种流感病毒的通用疫苗是可行的［5-6］。

目前，通用流感病毒疫苗的几个靶点主要包括HA 的保守茎部、基质蛋白 2（matrix protein 2，M2）离子通道的胞外域（M2e）、核蛋白（nucleoprotein，NP）和基质蛋白 1（matrix protein 1，M1）［3］。进入临床试验阶段的通用流感疫苗见表1。本文对基于流感病毒不同结构的通用疫苗种类、免疫原性、安全性及保护效力作一综述，旨在为通用流感疫苗的进一步研发提供临床前及临床理论依据。

表1 进入临床试验的通用流感疫苗一览表Tab.1 Universal influenza vaccines in clinical trial

1 基于流感病毒HA茎部的通用疫苗

HA是流感病毒包膜上一种刺突，其结构极不稳定，易发生变异，可刺激机体产生中和抗体。HA为一种三聚体，每个单体由更容易变异的球形头部区域HA1和更为保守的茎部区域HA2组成［7］。近年来，针对HA茎部区域广谱中和抗体（broad neutralizing antibody，bnAb）的通用流感疫苗是研究热点。但HA头部区域相对茎部区域更占免疫优势地位，这是诱导bnAb的阻碍因素之一［8］。目前针对HA茎部的通用流感疫苗主要有去头HA和嵌合HA两种策略。

1.1 去头HA的通用疫苗 2015年，ANTONIETTA等［5］基于 H1N1 A／Brisbane／59／2007流感病毒亚型的HA序列设计了稳定的三聚体HA茎部抗原mini-HA，该抗原可引发与组1（H1、H5及 H9）及组2（H3及H7）病毒HA高度结合的抗体，并可对抗同型或异型H5流感病毒的攻击。在此基础上，JOAN等［9］于2018年将mini-HA与H1亚型的全长HA对小鼠进行免疫接种，并对小鼠进行异型H5及H1病毒的攻击。结果发现，mini-HA可诱导针对H1N1及H5N1病毒的保护，接种最适剂量103 nmol／L mini-HA的小鼠对H1N1及H5N1攻击的存活率分别约为75%和80%，生存率及生存时间（21 d）均显著高于接种H1亚型的全长HA的小鼠，且mini-HA诱导的HA茎部特异性抗体滴度显著高于H1亚型的全长HA的小鼠。2015年，YASSIEN等［10］基于6个迭代化设计（Gen1～Gen6）合成连续缺乏免疫头部的H1 HA 稳定茎（H1 HA stabilized-stem，HA-ss），并将该构建体融合至细菌铁蛋白中，形成纳米颗粒，构建出更稳定的HA茎部抗原（HA-ss nanoparticles，HA-SS-np）。其在小鼠及雪貂体内可产生针对H1、H2、H3、H4、H7 及 H9 的抗体，由 H1-SS-np 引发的对HA茎部的抗体反应强于三价灭活流感疫苗。接种H1-SS-np且受致死剂量异型H5N1流感病毒攻击的小鼠及雪貂的存活率均为100%。VALKENBURG等［11］于2016年通过细菌表达多肽的设计，将HA茎部折叠成三聚体，模仿H5流感病毒HA茎部的预融合构象，研究发现，接种基于此三聚体疫苗的小鼠对致死剂量H5、H1及H3病毒攻击的存活率分别约为80%、60%和60%，且该疫苗可诱导异型H5、H1、H3及H7病毒的抗体，通过微量中和试验测定抗体滴度为1∶160～1∶640。无头HA抗原的主要缺陷在于缺乏重要的构象表位，若去除HA头部而未进行结构修饰以稳定残余分子可能导致HA茎部天然构象及bnAb结构表位的丢失［12-13］，也有学者提出，无头HA疫苗可能不适用于甲型流感组2病毒株及乙型流感病毒［8］。

1.2 嵌合HA（chimeric HA，cHA）的通用疫苗 cHA由各型流感病毒的茎部结构域与外来流感病毒株的头部结构域（大多数的禽类毒株）组成。通过用具有不同头部区域但相同茎域的cHAs进行连续接种，将免疫应答集中至免疫亚优势的茎部区域，从而打破头部结构的优势，增强针对保守茎部区域的免疫反应［12］。2013 年，KRAMMER 等［14］用不同流行季甲型H1N1流感病毒的H1茎部进行嵌合，再分别用H5、H6及H9流感病毒头部与该嵌合茎部构建出cHAs疫苗，研究显示，连续接受该疫苗免疫的小鼠在H5N1、H6N1及H7N9等多种病毒攻击后存活率均为100%，显著高于其各对照组，且产生了高滴度的茎部反应性抗体。该研究结果在另一小鼠实验中得到证实［15］。KRAMMER 等［16］在雪貂的实验中也证实cHA策略为通用流感疫苗的开发提供了可行性。其团队先后用头部为H9、H5、H6的cHA对雪貂进行免疫，在接种头部为H5、H6的cHA后，雪貂体内对大流行的H1N1病毒的血清反应性分别较前1次提高4和8倍。用A／Netherlands／602／09H1N1病毒对实验动物进行攻击，在感染的第4天，疫苗组雪貂嗅球、鼻甲、鼻洗液中的病毒滴度显著低于对照组。

基于HA茎部通用疫苗的缺陷之一在于对HA茎部抗体的诱导受限制，其原因可能与预先存在的茎部抗体引起的表位隐蔽有关［17］。这些抗体识别不相关的茎部抗原表位后，干扰对茎部表位中和抗体的诱导。也有学者认为，茎部抗体与病毒粒子的HA亲和力较低，导致抗原抗体结合率降低［18］。目前还有其他提高HA茎部免疫暴露的措施，如病毒样颗粒的表面移植、自组装纳米颗粒、异源-初免加强策略等［5，19］。

2 基于M2e的通用疫苗

M2为跨膜蛋白，在病毒侵染细胞时，充当离子通道，M2e为其胞外区［20］。M2e特异性抗体可与病毒感染宿主细胞上表达的M2e结合，通过补体或抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）机制杀死被感染的肺上皮细胞来减少病毒复制。M2e抗体不能中和病毒，但能刺激巨噬细胞，使其吞噬与抗体结合的流感病毒［20］。目前，国外已有公司研制出针对M2e的疫苗并进入临床试验阶段，其中由Vaxinnate公司生产的重组M2e-鞭毛蛋白流感疫苗（VAX102）于2008年完成了Ⅰ期临床试验（NCT00603811）。试验结果显示，0.3及1.0 μg的剂量可诱导抗M2e IgG滴度，在人体内抗体水平提高了4倍［21］。但M2e候选疫苗作为单独靶点的进一步临床开发已经停止，主要原因是M2e特异性血清抗体滴度在人体内快速下降［22］。

3 重组蛋白的通用疫苗

重组通用疫苗的目标蛋白主要指流感病毒的保守蛋白，包括NP及M1。这两种蛋白均为流感病毒的主要结构蛋白，较少发生变异，是人体发生细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T cell，CTL）反应的主要靶点，可增强T细胞交叉反应。由于活化的CD8+T细胞可攻击被病毒感染的细胞并增强病毒清除，因此，诱导CTL反应的疫苗可降低疾病严重程度及死亡率，但不能预防感染［23］。由于NP及M1引发的抗体无中和病毒能力，因此基于该部位的通用疫苗可能需与能产生由HA诱导的抗体的疫苗结合使用［24］。

3.1 MVA-NP+M1疫苗 由A／Panama／2007／99 H3N2病毒的NP和M1组成，并插入改良痘苗病毒安卡拉（modified vaccinia virus Ankara，MVA）的 MVANP+M1疫苗于2009年进入Ⅰ期临床试验（NCT00-942071）［25］。28名志愿者随机分成3组，分别接种5×107、5×107及2.5×108pfu剂量的疫苗。在Ⅱ期临床试验中（NCT00993083），27名50～85岁志愿者随机接受单次肌内注射1.5×108pfu疫苗或安慰剂，第30天均接受A／Wisconsin／67／2005病毒鼻内给药［26］。通过IFNγ ELISpot试验测定T细胞反应，发现试验组在第29天中位响应值为627 SFU／106外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），显著高于对照组，且活性更强。试验组流感患者症状较轻，其病毒脱落时间为0.45 d，对照组为1.09 d。其安全性与其他MVA载体疫苗相当，未报告严重的全身不良事件。该研究首次证明了基于T细胞的通用流感疫苗的临床疗效，阐明该疫苗在促进T细胞反应及减少实验室确诊的流感的有效性，提供了疫苗效力的初步证据，使受试者实验室确诊流感发病率降低60%。MVA-NP+M1疫苗将进一步开展临床研发。

3.2 ChAdOx1-NP+M1疫苗 ChAdOx1-NP+M1疫苗是将A／Panama／2007／99 H3N2病毒的NP和M1插入至黑猩猩腺病毒载体制成，于2014年完成Ⅰ期临床试验（NCT01623518）［27］。试验结果显示安全性良好，5 × 108、5 × 109、2.5 × 1010及 5 ×1010vp剂量组第14天的IFNγ值与基线值相比分别增加了3、6、7和4倍。选择2.5×1010vp的剂量用于ChAdOx1 NP+M1的进一步研究。在同一临床试验中，用ChAdOx1-MVA进行初免-加强免疫，结果显示，用ChAdOx1为载体的疫苗进行初次免疫，用MVA为载体的疫苗进行加强免疫，可显著增强疫苗的免疫原性。

3.3 Multimeric-001（M-001）疫苗 M-001疫苗是由以色列BiondVax公司开发的一种重组蛋白疫苗，含甲型H1N1、H3N2及乙型流感病毒株的HA、NP和M1的9个保守表位。在首次人体试验中（NCT008-77448），60名18～49岁的健康志愿者分为5组，分别接受 2 次 250 μg 无佐剂、250 μg 含佐剂、500 μg无佐剂、500 μg含佐剂的M-001及安慰剂的肌肉注射，42 d后，接种500及250 μg含佐剂疫苗的人群对M-001蛋白的IgG滴度分别增加了50和37倍。接受500 ug剂量的人群PBMC对甲型 H1N1、H3N2及乙型流感病毒均产生70%以上的增殖反应，并观察到IL-2、IFNγ细胞因子的增长［28］。一项在中老年群体中开展的多中心Ⅱ期临床试验中（NCT014-19925），120名志愿者按 1∶1∶1∶1随机分成 4组，分别接受2次无佐剂、单次无佐剂、单次含佐剂的500 mcg M-001或单次安慰剂，在末次注射后检测了11种异性流感病毒（3种H1亚型、5种H3亚型及3种乙型）的HI抗体转化率，结果显示，疫苗组对所有病毒的HI抗体转化率均高于对照组，其中4种病毒显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。试验还使受试者体外暴露于甲型H1N1、H3N2及乙型流感病毒抗原，观察M-001诱导的细胞免疫反应，发现产生IFNγ的CD4+和CD8+T细胞显著增多。表明M-001在体液及细胞免疫反应中对流感病毒株均具有交叉保护作用，且安全性良好［29］。该疫苗于2019年4月完成Ⅲ期临床（NCT03450915）的志愿者招募，预计2020年可获得Ⅲ期临床结果。

4 合成多肽疫苗

4.1 FLU-v疫苗 由英国SEEK公司生产的一种由人及动物甲型、乙型流感病毒的NP、M1和M2的高度保守区域合成的多肽通用疫苗FLU-v经Ⅰ期临床试验（NCT01181336）后［30］，选定剂量为 500 μg的疫苗进入Ⅰb期试验（NCT01226758）［31］。2017 年 7月，FLU-v疫苗Ⅱb期试验（NCT02962908）完成，222名18～60岁健康志愿者按2∶2∶1∶1随机分为FLU-v＋盐水组、FLU-v＋佐剂组、2剂盐水组及安慰剂＋佐剂组，分别于第0及21天接种相应剂量的疫苗，观察第42及180天的Th1免疫应答。在2016-2017年流感季节期间，所有志愿者通过网络调查问卷记录流感发病情况，进一步评估该疫苗的安全性及免疫原性［32］。在Ⅱb期试验FLU-v＋佐剂组中，42及180 d PBMC分泌的IFNγ较第0天至少增加2倍的受试者比例分别为95.46%和93.02%，均显著高于安慰剂组，且每组FLU-v受试者在第42及180天的IgG抗体滴度均显著高于安慰剂组［33］。另一项关于FLU-v疫苗的随机、三盲、安慰剂对照Ⅱb期临床试验（NCT03180801）于2017年5月完成，旨在研究该疫苗在健康人群的甲型H1N1流感模型中的效力；123名志愿者随机分成1剂FLU-v组、2剂FLU-v组及安慰剂对照组，第0天用含2009年甲型H1N1流感病毒的PBS悬液对每位志愿者进行鼻喷雾器给药，监测受试者轻度至中度流感的发病情况［33］。在Ⅱb期流感模型的效力试验中，两组FLU-v受试者及对照组中轻度至中度流感发病率分别为32.5%、32.6%和54.8%［34］。以上研究公开发表的结果及Clinical Trial临床试验平台公布的数据表明［31，33-34］，FLU-v疫苗在健康成年人中的安全性及耐受性均良好，大多数不良反应报告为轻度至中度，未发生严重不良反应事件。在500 μg剂量的FLU-v受试者中，均诱导了特异性FLU-v细胞免疫。FLU-v疫苗将进入Ⅲ期临床试验。

4.2 FP-01.1疫苗 2015年，一种由从人、禽类及猪体内分离的H1～H9甲型流感病毒株高度保守蛋白（NP、基质蛋白、多聚酶蛋白1、多聚酶蛋白2）合成的广谱甲型流感疫苗FP-01.1进入双盲、安慰剂对照临床试验（NCT01265914）。49名受试者随机分成3个剂量组（50、150和 500 μg／肽）及安慰剂组。研究发现，FP-01.1疫苗可诱导CD4+和CD8+T细胞应答，3个剂量组的IFNγ与免疫前比较均显著增加，其中150 μg／肽组显示出最强的免疫原性，第43天中位响应值为243 SFC／106PBMC，而对照组无人发生应答［35］。为验证疫苗诱导的特异性T细胞交叉识别不同流感病毒株H1N1及H3N2，将病毒与A549细胞（表达HLA-A2的人肺上皮细胞系）温育，发现疫苗接种后对H1N1、H3N2的IFNγ及颗粒酶B浓度显著高于接种前［35］。另外，FP-01.1安全性良好，疫苗接种者的不良事件发生情况与对照组相似。

5 问题与展望

目前，国内对通用流感疫苗的研究存在局限性，而国外近10年开展了大量研究。NIAID虽于2017年召开了关于通用流感疫苗研讨会并提出其具体目标，但目前关于通用疫苗临床终点的判定仍存在争议。国外已研制出多种针对流感病毒不同靶点的候选疫苗，且在动物实验及早期临床阶段均显示出较好的安全性、耐受性及免疫原性，但迄今尚无通用疫苗完成Ⅲ期临床试验。这可能与流感病毒型别和蛋白多样、不断变异、在临床前与临床评价中的经济成本、市场监管及相关政策等有关。因此，通用流感疫苗的进一步研发可考虑针对流感病毒的所有有效靶点［1］。在疫苗评价中，有必要扩大研究规模，继续开展多中心临床试验，进一步证实通用疫苗的安全性及免疫原性。

动物实验在疫苗临床前评价阶段具有重要作用，但动物模型具有一定局限性。无论是雪貂还是小鼠均无法完全重现人类流感病毒感染的全过程，其免疫机制、暴露途径及易感模式与人类不同，可能导致动物实验与临床数据的结果存在差异。另外，无论在动物实验还是人体研究中，病毒攻击是评价疫苗免疫效果的有效方法，但病毒模型与自然感染存在本质差别。在候选疫苗的评价中应充分考虑以上因素，标准化流感病毒攻击株、疾病模型及感染途径，充分了解动物及人针对不同流感病毒的感染过程和免疫机制，将动物攻毒模型的数据与人自然感染的数据进行多元化比较［6］。

在通用流感疫苗临床评价阶段，应重点考虑儿童、老人、孕产妇及患基础疾病的免疫力低下者。与年龄或体重相关的免疫功能变化可能导致流感疫苗效力的下降，因此，在正常人群中开展通用疫苗的早期临床试验结果可能不适用于高危人群。为保证重点人群对抗不断变异流感病毒的长久有效免疫力，可能还需考虑通用流感疫苗的多次接种［1］。预计一些候选通用流感疫苗可在5年内进行后期临床试验，一种商业化的通用流感疫苗可能在8～10年内上市［36］。