人类白细胞抗原-DPA1基因多态性与无胚胎妊娠的相关性

王振东，卢晓琳，姚秀英，刘鑫丽，赵琳琳，王理，牛勃，4

1.山西医科大学生化教研室，山西 太原 030001；2.首都儿科研究所分子免疫室，北京 100020；3.陆军总医院263临床部妇产科，北京 100024；4.首都儿科研究所转化医学研究室，北京 100020

无胚胎妊娠也称为枯萎卵妊娠，是指胚胎从未发育或再吸收，最终导致流产。无胚胎妊娠通常发生在怀孕妇女流产前12周，是妊娠早期较常见的流产，占自然妊娠的50%［1-3］。有研究表明，无胚胎妊娠可能与感染、免疫、染色体异常、内分泌等多种因素相关［4］。

胎儿一半的遗传物质源于父本，因此可能会引起母体免疫系统的排斥反应，有研究证实，胚胎着床是母体胎儿复杂的免疫耐受过程，免疫系统调节在该过程中发挥重要作用［5］。妇女在育龄期发生自然流产大多数存在免疫异常现象，其中约80%的复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）与自身免疫因素相关［6-7］。

人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）也称为主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC），负责免疫系统中的抗原表达，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类［8］。HLAⅠ类分子是NK细胞受体的配体，具有阻断NK细胞活性的能力，起到保护胎儿的作用。胎盘滋养层细胞表达3种HLAⅠ类分子（HLA-C、HLA-G、HLA-E），有研究证实，HLAⅠ类基因的缺失或突变可能导致流产［8］。AGRAWAL等［9］研究发现，HLA-G基因多态性增加了RSA的风险。HLAⅡ类分子是一种固定在细胞膜上的异质二聚体，由1条α链（DPA1）和1条β链（DPB1）构成，结合细胞外源性抗原肽后，可被CD4+T细胞识别，胎盘滋养层HLAⅡ类抗原的抑制是妊娠成功的一个重要机制。研究已经证实，HLAⅡ类分子在胎盘滋养层细胞中的过表达可能诱发流产，但其具体机制尚未明确［10］。HLAⅡ类分子包括HLA-DP、DQ、DR、DN、DO和DM 共6个亚型，有研究发现，复发RSA患者体内存在大量HLA-DQ或HLA-DR的表达［11-12］。目前对HLA-DP与流产相关性的研究较少，因此本研究采用高通量DNA分析技术，检测无胚胎妊娠妇女外周血中HLA-DPA1基因的14个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），并分析HLA-DPA1的遗传多态性与无胚胎妊娠的相关性。

1 材料与方法

1.1 样本 选择2016年5月～2018年9月间由中国人民解放军总院263医院经产前B超检查确诊为无胚胎妊娠的110名患者作为研究对象，同时招募150名因非医疗原因流产患者作为对照。所有参与者均为汉族，无家族病史、特殊疾病及其他药物作用和辐射效应，且均已提交知情同意书。本研究方案经当地伦理委员会和首都儿科研究所IRB审核通过。经患者静脉采集外周血，于-30℃保存。同时记录研究对象的年龄及孕周。

1.2 主要试剂及仪器 血液和细胞培养DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；NANODROP 1000分光光度计购自美国Thermo公司；带有基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）的质量阵列高通量DNA分析仪购自美国Angena公司。

1.3 DNA的提取 采用血液和细胞培养DNA提取试剂盒从血液样本中提取基因组DNA，通过NANODROP 1000分光光度计测定260和280 nm波长下的吸光度值，检测DNA的浓度和纯度。

1.4 SNP的选择及基因分型 从1000 Genomes数据库中筛选出启动子和HLA-DPA1基因全长区域的标记SNP，分别从NCBI SNP数据库和NCBI pubmed数据库中获得外显子SNP和热点SNP，利用Haploview 4.2软件分析上述SNP的连锁相关性。

在 AgenaCx网站（https：／／agenacx.com／）设计汉族人群中等位基因频率>0.10且与其他SNP有强连锁不平衡的SNP（n=19）引物，设定r2<0.8，引物序列见表1，引物由生工生物工程（北京）股份有限公司合成。以提取的样本基因组为模板，PCR扩增SNP区域，PCR产物通过质量阵列高通量DNA分析仪进行分析，同时以纯水作为阴性对照，并对60%的样本进行再分型，对基因分型频率≥90%的HLA-DPA1基因的SNP进行基因型／等位基因频率的分析。其他群体中SNP基因型／等位基因的频率从1000 Genomes数据库中获得，并验证与对照组样本的相关性。

表1 SNP扩增的引物序列Tab 1.Primer sequences for SNP regions

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行分析，所有统计检验均为双侧，哈温平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）的比较采用卡方检验；以OR值的 95%置信区间（confidence interval，CI）为标准进行多元线性回归，判断与HLA-DPA1多态性相关的无胚胎妊娠风险；病例组和对照组孕周的比较采用独立样本t检验。均以P<0.05为差异有统计学意义。在5%显著性水平下，基于110例病例和150例对照的最小样本量，应用Quanto软件（http：／／biostats.usc.edu／Quanto.html）计算，当 OR 为 0.5时，检测能力为99.99%。

2 结果

2.1 受试者年龄及孕周的比较 对照组及病例组受试者的平均年龄分别为（28.35±6.13）和（28.86±7.15）岁，平均孕龄分别为（6.84± 1.22）和（6.93±1.34）周，差异均无统计学意义（t分别为0.63和0.55，P分别为0.532和0.585）。

2.2 DNA的浓度及纯度 对照组及病例组受试者血液样本中提取的DNA浓度均在40 ng／μL以上，可用于PCR扩增，其在260与280 nm处的光吸收比值除少量在1.7～1.8或2.0～2.1之间，其他均在1.8～2.0之间；其在260与230 nm处的光吸收比值除少量在1.85～2.0之间，其他均在2.0以上。见表2。表明无过量蛋白质、RNA或酚类物质污染，可用于后续试验。

2.3 HLA-DPA1基因频率与样本基本参数分析Haploview 4.2软件分析结果表明，HLA-DPA1基因中共有14个SNP位点基因分型频率在90%以上，除rs2073522在P<0.05时偏离HWE外，共对13个SNP位点进行统计分析，见表2。组间比较频率时发现，除rs1431403外，所有SNP的基因型和等位基因分布在对照组和无胚胎妊娠组间非常相近（数据未显示），rs1431403基因分型多态性检出率为94.23%，其中对照组为143例，病例组为102例。

表2 SNP的详细参数Tab.2 Detail parameters of SNP

2.4 rs1431403位点的基因型及等位基因多样性分析 基因型／等位基因频率分析结果表明，对照组与病例组rs1431403位点的等位基因频率间无统计学意义（P>0.05），但纯合子基因型（CC 和 TT）明显高于对照组（P<0.01），病例组纯合子突变组合（CC+TT）部分也显著高于对照组（P<0.001），见表3。表明该人群中rs1431403多态性可能与无胚胎妊娠风险呈正相关。

表3 对照组和病例组rs1431403位点基因型的比较Tab.3 Comparison of rs1431403 genotypes in two groups

2.5 rs1431403位点基因型和等位基因频率在不同人群中的多态性分析 对照组rs1431403位点基因型／等位基因频率与北京其他正常汉族人群间差异无统计学意义（P>0.05），除日本和非洲人群的等位基因频率与对照组差异无统计学意义外（P>0.05），包括西双版纳中国傣族人口在内的其他亚洲国家或其他洲的外国人群的rs1431403位点基因型／等位基因频率差异均有统计学意义（P<0.05），见表4。表明对照组rs1431403位点基因型／等位基因频率可代表汉族人群，且rs1431403位点在不同民族或种族人群中具有不同的基因型／等位基因频率分布。

表4 不同民族或种族正常人群rs1431403位点基因型和等位基因频率的多态性Tab.4 Polymorphisms of frequencies of rs1431403 genotype／allele in healthy populations of various nationalities or races

3 讨论

本实验基因分型结果表明，病例组CC与TT分型为40.2%和30.4%，分别比对照组高出19.2%和10.8%，CT分型为29.4%，比对照组低30.0%，病例组纯合子突变组合（CC+TT）部分为70.6%，比对照组高30.0%；分型差异结果表明，HLA-DPA1基因中SNP位点rs1431403与无胚胎妊娠有显著相关性，纯合子基因型（CC和TT）明显增加了无胚胎妊娠的风险。本实验还将对照组中rs1431403位点基因型／等位基因频率与北京其他正常汉族人群（1000 Genomes数据库）进行了比较，两组间差异无统计学意义（P>0.05），该结果进一步证实了对照组rs14-31403位点基因型／等位基因频率可代表汉族人群，其分布与包括西双版纳中国傣族人口在内的其他亚洲国家或其他洲的外国人群相比，差异有统计学意义（P<0.05），表明rs1431403位点与无胚胎妊娠的关系在不同民族中可能存在差异。

有研究发现，rs1431403位点的基因变异同时存在于HLA-DPA1和HLA-DPB1的内含子区域，可能与类风湿关节炎、1型糖尿病等自身免疫性疾病和HIV等免疫缺陷相关［13-14］。HLAⅡ类分子与外源性抗原结合为复合物，与CD4+T淋巴细胞（Th）表面受体（T cell receptor，TCR）结合，CD4+Th 的活化引起Th细胞增殖，表达相应的淋巴因子，进而启动体液免疫［15］，表明HLAⅡ类分子增加可刺激CD4细胞上升。FERRERIA等［14］发现，rs1431403的C等位基因在Ⅰ型糖尿病和HIV中均可引起CD4／CD8的下调。YANG等［13］发现，rs1431403位点的变异显著增加类风湿性关节炎的发生，HLAⅡ类分子表达上调是类风湿性关节炎的检测指标之一；也有研究表明，类风湿关节炎风险与HLA的基因多态性密切相关［16］。综上所述，rs1431403位点的基因型与HLADPA1的表达可能存在关联，rs1431403位点基因型可能是影响无胚胎妊娠发生的途径，但具体病理机制有待进一步研究。转录因子结合位点预测（Alibaba 2.1，gene-regulation.com／pub／programs／alibaba2／index.html）发现，rs1431403下游4 bp处为干扰素共识序列结合蛋白（ICSBP）结合位点，ICSBP能够促进HLA-DP表达［17］，但ICSBP与该位点的结合是否受rs1431403位点突变调节尚需证实。

综上所述，HLA-DPA1中rs1431403位点的纯合分型（CC或TT）是中国人群胚胎停育的潜在危险因素，该结果可能为自然流产的产前诊断提供线索，对优生优育具有积极意义。