昆虫细胞在预防性疫苗中的应用及外源因子的控制

任慧梅，陈庆华 综述，李敏 审校

国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022

1983年，SMITH等［1］采用昆虫杆状病毒感染昆虫细胞，成功表达重组人β干扰素，标志着昆虫细胞-杆状病毒表达系统的诞生。此后，昆虫细胞基质作为杆状病毒载体的宿主，广泛应用于重组蛋白的表达。在疫苗领域，昆虫细胞-杆状病毒表达系统的生产平台也越来越受到关注，已有多种采用该系统生产的人用或兽用商品化疫苗上市［2-3］。但近年来随着科学技术的发展，多种昆虫细胞系被发现存在外源性病毒的持续感染［4］，因此，昆虫细胞作为生物制品生产用细胞基质的安全性引起人们的密切关注。

近期在我国进行预防用生物制品临床试验申报的药学研究资料中，发现有些研发企业选用了昆虫细胞-杆状病毒表达系统进行重组抗原的生产，审评对其昆虫细胞外源因子的控制进行了关注。本文综合了预防用生物制品药学审评过程中对外源因子的考虑，对杆状病毒表达系统中最常用的两种昆虫细胞基质SF9和High Five的外源因子控制，及该昆虫细胞系应用于预防性疫苗时的药学研发考虑进行探讨。

1 昆虫细胞-杆状病毒表达系统

杆状病毒（baculovirus）载体可在昆虫细胞中表达外源蛋白，且不能在哺乳动物细胞中复制，对包括人在内的哺乳动物无致病性，具有很好的生物安全性［5-6］。目前研究和应用最为广泛的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）［2］。

分离自鳞翅类昆虫的SF-9和High Five（Hi-5）是杆状病毒表达系统中常用的昆虫细胞基质［7-8］。除了SF-9和Hi-5外，在过去30多年中，从鳞翅类昆虫分离到多种可用于杆状病毒表达系统生产人用或兽用生物制品的昆虫细胞系［5，9］。

昆虫细胞-杆状病毒表达系统能对表达的重组蛋白进行多种翻译后修饰，如二硫键形成、磷酸化、酰化、糖基化、寡聚化和折叠［5］。由于其构建简单，易于放大，效率高，既可表达单一的抗原蛋白，也可表达复合蛋白，并可在细胞内形成具有良好抗原性的病毒样颗粒，昆虫细胞-杆状病毒表达系统已成为被广泛认可的生产重组蛋白的平台及生产疫苗抗原的有效工具［3，10-11］。

2 昆虫细胞-杆状病毒表达系统在疫苗中的应用

预防性疫苗领域相对保守，由于接种疫苗的人群基本上都是健康人，包括儿童，安全性对疫苗来说最为重要。而且在重组疫苗领域，已有被广泛接受的哺乳动物细胞培养平台、大肠埃希菌及酵母培养平台，其安全性均已获得临床证明。虽然昆虫细胞-杆状病毒表达系统具有一系列的优点，但其应用于预防性疫苗生产时仍需格外慎重，外源因子的质控必须严格执行。

迄今为止，采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统生产的人用预防性疫苗已有两个产品上市：第1个是葛兰素史克公司采用Hi-5细胞研发的人乳头瘤病毒样颗粒（HPV16和18双价）疫苗Cervarix，该疫苗于2007年在欧洲上市，于2016年在中国批准进口注册；第2个是由Protein Science公司采用SF9细胞制备的三价重组人流感病毒疫苗Flublok，于2013年上市，另外，Flublok四价疫苗于2016年在美国首次上市。除上述上市产品外，还有多个采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备的预防性疫苗处于临床研究或临床前研究阶段，如：埃博拉疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗、诺如病毒疫苗、B19微小病毒疫苗等［12］。上述疫苗均采用SF9或Hi-5细胞生产，且选用SF9细胞进行研究的疫苗数量远多于Hi-5细胞。

此外，Dendreon公司生产的治疗性疫苗Provenge于2010年被FDA批准上市，该疫苗是一种自体前列腺癌治疗产品，其抗原为采用SF21细胞生产的由人前列腺酸磷酸酶和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合成的重组蛋白［11］。UniQure公司采用SF9细胞生产的基因治疗药物Glybera于2012年在欧洲上市，用于治疗罕见病脂蛋白脂酶缺乏症［11］。除以上4个已上市的人用生物制品外，还有多个采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统生产的重组兽用疫苗已上市［12］。

3 昆虫细胞SF-9和Hi-5中的外源因子

鉴于SF-9和Hi-5是杆状病毒表达系统中最常用的昆虫细胞基质，且已上市的两种预防性疫苗亦采用以上两种昆虫细胞作为生产用细胞基质，因此本文关注了SF9和Hi-5细胞中的外源因子。

2014年，几乎同一时间由3个不同团队在不同的SF细胞系中独立发现了弹状病毒（SF-rhabdovirus）［4，13-14］。后续研究表明，SF 毛虫的持续感染是最近在SF细胞系中发现的弹状病毒感染的最终来源，SF21、SF9L5814和SF9细胞系均表现出弹状病毒污染［4］。SF弹状病毒的宿主范围相对较窄，极可能仅限于少数鳞翅目昆虫物种和细胞系［15］。截至目前为止，尚未发现SF弹状病毒在任何细胞株中引起细胞病变的报道，也未发现感染或易感染SF弹状病毒的哺乳动物细胞株［4，15-16］。

其中FDA生物制品评价与研究中心（Center for Biologics Evaluation and Research，CBER）通过高通量测序（massive parallel sequencing，MPS）发现 SF9昆虫细胞中存在内源性弹状病毒。研究人员在SF9细胞中检测到弹状病毒5个主要基因的片段，几乎包含其所有主要基因组及结构蛋白，而且转录水平能检测到基因转录，电镜观察能检测到极少量的弹状病毒颗粒。即SF9细胞中的弹状病毒仍有以完整病毒形式存在的可能。该研究建议在生产的不同阶段应进行敏感性检测，也可通过相关的病毒模型，结合病毒去除步骤，检验生产过程的病毒安全性［14］。后续FDA跟踪报道，说明所有昆虫细胞来源的已上市疫苗产品，均对整个生产过程进行评估以证实不含外源病毒，其工艺均可保证生物制品的安全性［17］。

基于SF9细胞制备的重组人流感病毒疫苗（美国 Protein Science公司，FlublokTM）已于 2013年经FDA批准上市，Protein Science公司发表文献，说明该SF9细胞上清中可检测到弹状病毒的基因，但该基因缺失320个核苷酸，缺失序列包括X、L基因的转录基序；将SF9细胞上清经密度梯度离心处理得到1.14 g／mL条带，经电镜分析认为，该条带为无定型微粒，即未形成弹状病毒颗粒；对该条带进行SDS-PAGE、LC-MS／MS分析，显示为exosome蛋白、弹状病毒N蛋白、截短的NPG蛋白；1.14 g／mL条带可将杆状病毒基因转染SF9细胞，该结果与exosome功能一致［18］。与FDA发表的文献不同，该研究未在SF9细胞中检测到病毒颗粒，认为可能与SF9细胞的批号及传代历史不同有关，并认为不同来源的细胞检定结果难以外推至其他细胞［18］。

此外，有研究提示，某些SF9细胞系中弹状病毒基因组整合至细胞基因组上，以转录单元存在［12］。总体来说，到目前为止，弹状病毒在昆虫细胞中的存在形式有不同的结论，但感染性试验的结论基本一致，即弹状病毒可以感染同类昆虫细胞，但不感染人和其她哺乳动物细胞［15，19-20］。

2007年，日本国家传染病研究所在Hi-5中发现粉纹夜蛾细胞系病毒（trichoplusiani cell line virus，TnCLV）［21］。TnCLV与一种特征明显的昆虫病毒—兽棚病毒（flock house virus，FHV）相似，又被称为兽棚病毒变异株（flock house virus variant，FHVvar），其与FHV核苷酸及氨基酸序列同源性为80%左右，且TnCLV衣壳蛋白可被一种多克隆抗FHV抗血清识别［21］。与弹状病毒不同，TnCLV及FHV一般不被认为是哺乳动物病原体，因此与SF弹状病毒相比，对TnCLV污染的细胞株和易感性的研究较少。目前已知的只有粉纹夜蛾Tn衍生的昆虫细胞系受到TnCLV 的污染，SF 细胞中不存在 TnCLV 污染［4，21］。

除外源病毒污染外，SF9和Hi-5细胞的逆转录酶检测均为阳性。此外，有证据表明，SF9细胞可被圣路易斯脑炎病毒、登革热病毒、日本乙型脑炎病毒、切昆贡亚热病毒感染，因此建议企业关注昆虫细胞中虫媒病毒的检定［4］。

4 昆虫细胞应用于预防性疫苗时的药学研发考虑要点

SF-RVN是目前唯一报道的无任何可检测到弹状病毒污染的SF细胞株，其形态、生长特性、对杆状病毒感染的反应和重组蛋白产量均与SF9差异不大［18，20］，但比 SF9 具有更好的生物安全性，更适用于生物制品的生产［4］。此外，据了解，国内也有企业购买商业化SF9细胞后，经单克隆筛选得到弹状病毒阴性的SF9细胞。鉴于国内外均已获得不含弹状病毒的SF9细胞，因此建议有意愿采用SF9昆虫细胞进行疫苗研发和生产的企业，尽量在研发早期选用无外源病毒污染的细胞株。

弹状病毒的发现（2014年）是在含有弹状病毒的SF9细胞生产的Flublok上市（2013年）之后，并且之后FDA批准了Flublok的四价流感疫苗。基于此，有些研发企业认为若后续的病毒灭活和工艺控制可完全去除弹状病毒，使用含有弹状病毒的SF9细胞进行预防性疫苗的生产是可以接受的。虽然目前尚无证据表明弹状病毒对人具有感染性，但在已知SF9细胞含有弹状病毒的前提下，作为生产中的外源病毒仍具有潜在的风险，在我国进行临床试验申报仍建议研发企业深入鉴定、评价所用的SF9细胞，如基因组测序、转录组测序、质谱、电镜检测等，明确弹状病毒是以核酸片段形式存在，还是以病毒颗粒形式存在。若弹状病毒以病毒颗粒形式存在，则不符合《中国药典》“疫苗总论”要求：种子批无外源因子污染。若确认不是以完整病毒存在，而是以核酸片段存在，则需阐明存在方式，并加强细胞库和毒种库以及生产工艺中间品的检定：如增加弹状病毒检测靶点、转录或蛋白水平检测等，确保无污染风险。只有以核酸片段的形式存在，才能进一步评估产品的必要性和获益，以及该疫苗临床是否急需综合评价，考虑开展早期临床试验。但若要进入Ⅲ期临床试验，毒种制备用SF9细胞应使用克隆筛选后无弹状病毒污染的细胞株，即Ⅲ期临床前需完成无弹状病毒污染细胞株的筛选。

在审评过程中曾发现采用Hi-5细胞进行生产的某产品，在其研发早期，种子库中检测到FHVvar病毒RNA，并通过电镜在细胞质中观察到一种病毒颗粒样结构。审评采用与上述SF弹状病毒一致的原则，要求申请人进行广泛研究（参照上述SF弹状病毒），明确该外源病毒的存在形式，并证实该外源因子不具备在哺乳动物细胞中扩增和感染的能力，同样，若要进入Ⅲ期临床试验，应筛选不含FHVvar的细胞株。后期申请人采用终点稀释法对该细胞进行克隆和筛选，得到不含FHVvar病毒RNA的Hi-5细胞克隆，并采用该细胞株重新建立了生产用细胞库，FHVvar RNA检测阴性。出于安全性考虑，药审中心仍要求申请人在研发相关阶段对产品进行FHVvar病毒检测，且结果应为阴性。

据文献报道，国外几个研究小组已独立获得6个无TnCLV污染的Tn细胞系，但这些细胞系的克隆状态、特征程度均不同［4］。据了解，国内也有生产企业通过多轮细胞亚克隆及筛选，成功获得了不含TnCLV的Hi-5细胞株。因此，建议疫苗研发和生产企业尽量在研发早期选用无TnCLV污染的Hi-5细胞。

目前已上市的疫苗除乙肝疫苗使用的CHO细胞外，生产用细胞基质均未见逆转录酶活性阳性。《中国药典》生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程中，对生产用细胞基质逆转录酶及逆转录病毒的要求为：若细胞逆转录酶活性检测为阳性，则需进行透射电镜检查或PCR检测及感染性试验，以确证是否存在感染性逆转录病毒颗粒。可产生感染性逆转录病毒颗粒，且下游工艺不能证明病毒被清除的细胞基质不得用于生产。因此，疫苗研发企业应按照《中国药典》的要求，进一步确认SF9和Hi-5细胞是否含有逆转录病毒，并建议在原液中进一步阐明是否有逆转录病毒序列，开展昆虫细胞中逆转录酶活性相关的转座子风险研究。

目前WHO细胞基质技术指南和FDA细胞基质技术指南均无对昆虫细胞细胞基质残留的定量限度要求。建议申请人采用目前国内外具有一定认可程度的昆虫表达体系试剂盒或斑点杂交法进行残留DNA、残留宿主细胞蛋白的检测。原则上，在方法学可比的基础上，昆虫细胞基质残留应不高于已上市同类产品的要求。此外，对于DNA残留应结合成瘤性检测综合评估，虽然体内法是成瘤性评估的“金标准”，但昆虫细胞的生长温度为27℃，因此成瘤性试验采用的动物模型（动物体温为37℃）不适用，可考虑进行软琼脂克隆作为参考，并进一步对核酸残留进行质控，以进行更好的风险评估。由于昆虫细胞基质可参考上市产品较少，对于宿主细胞蛋白及DNA残留风险的相关研究较少，企业应在临床前研究中充分评估安全性风险后，再考虑开展人体临床研究。

昆虫细胞-杆状病毒表达系统依赖于杆状病毒的增殖生产目的蛋白，因此，杆状病毒的去除为生产过程中的关键工艺参数。疫苗研发和生产过程中，需参照《中国药典-人用疫苗总论》、《重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价一般原则》以及ICH Q5A《来源于人或动物细胞系生物技术产品的病毒安全性评价》指南的要求，制定全面系统的病毒去除／灭活措施以及严格的标准，以控制产品潜在的病毒污染。此外，病毒灭活后应考察灭活剂对重组蛋白完整性、免疫原性的影响，并对抗原蛋白的回收率等进行研究。

由于昆虫细胞的生存环境使其经常受到外源病毒的污染，考虑到目前的技术发展水平，昆虫细胞系只有在经过严格的检测，以及生产过程中的严格质控，才能被认为无外源病毒。因此，昆虫细胞被用于生物制品生产或研究之前，应广泛检测其是否存在外源病毒污染，并在生产过程中实施严格的措施以避免污染。若已选择的昆虫细胞含有外源病毒，应对该外源病毒进行广泛研究，尽量通过各种技术手段去除外源病毒污染。

综上所述，由于对昆虫细胞的前期研究、背景资料和致瘤性风险等积累的认识十分有限，其开发应用将引入新的安全性隐患，需慎重权衡利弊，在开展充分研究的基础上严格控制潜在的风险性。