普鲁士蓝显色光度法测定牛奶中β-内酰胺酶的含量

戴兴德，郑小芳，火文琴，张小林

甘肃医学院药学系，甘肃 平凉 744000

青霉素残留是乳制品行业一个重要监控指标［1-2］，为逃避打击，一些不法商贩在牛乳中添加抗生素分解剂（β-内酰胺酶）以分解牛乳中残留青霉素。β-内酰胺酶又称青霉素酶，可水解青霉素类物质而使其失效［3］，常用于青霉素药品的无菌试验［4］。β-内酰胺酶会造成β-内酰胺类抗生素耐药性，危害消费者身体健康［5］，因此，实施牛奶中β-内酰胺酶定量十分必要。目前，β-内酰胺酶的检测方法有碘量法［6-8］、pH 法［9-10］、微生物法［11-16］、高效液相色谱法［17］、紫外光度法［18］等，这些方法过程复杂，大多以定性为主，检出限偏高。

青霉素分子中的硫原子可将Fe3+还原为Fe2+（青霉素水解产物青霉噻唑酸与Fe3+不反应），Fe2+与［Fe（CN）6］3-反应生成可溶性普鲁士蓝 KFeⅢ［FeⅡ（CN）6］，β-内酰胺酶阻止该显色反应，吸光度值（A）下降，可根据ΔA计算β-内酰胺酶的浓度。本研究根据该原理建立牛奶制品中β-内酰胺酶残留量的普鲁士蓝显色光度法，并进行优化及验证。

1 材料与方法

1.1 样品 脱脂奶粉及鲜牛奶均为市售产品。

1.2 主要试剂 β-内酰胺酶冻干粉（批号：B1728048，标示量为10 MU）购自上海一研生物科技有限公司；青霉素钠（标示量：400万单位，总质量：2.4 g）购自哈药集团有限公司；硫酸铁铵（分析纯）及硫氰酸钾（分析纯）购自天津市瑞金特化学品有限公司。

1.3 溶液的制备 β-内酰胺酶储备溶液：将β-内酰胺酶冻干粉用1 000 mL的PBS溶解，采用碘量法［6］标定；β-内酰胺酶标准溶液：临用前将储备溶液稀释为200 U／mL；800 U／mL青霉素溶液：称取0.12 g青霉素钠，用pH 7.0的PBS溶解，定容至250 mL（1 mg青霉素钠效价为 1 667 U）；0.01 mol／L Fe3+硫酸溶液：精确称取2.66 g硫酸铁铵，用20 mL硫酸（1mol／L）溶解，定容至 1000mL；0.1mol／L［Fe（CN）6］3-溶液：取硫氰酸钾9.7 g，蒸馏水溶解，定容至1 000 mL；醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH 4.5）：取醋酸钠 18 g，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀释至1 000 mL；实验用水均为蒸馏水。

1.4 方法的建立 将5 mL的800 U／mL青霉素溶液与β-内酰胺酶标准溶液混合，于37℃水浴；加入0.01 mol／L Fe3+硫酸溶液，水浴；水流冲洗冷却，依次加入5 mL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH 4.5）和0.1 mol／L［Fe（CN）6］3-，蒸馏水定容至 50 mL，用1 cm比色皿，以蒸馏水作参比，经分光光度计测定吸光度值（A）。

1.5 方法的优化

1.5.1 吸收波长的确定 将青霉素溶液与4.00 mL β-内酰胺酶标准溶液混合，37℃水浴15 min，加入Fe3+硫酸溶液 5 mL，100 ℃水浴 20 min，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液 5 mL，［Fe（CN）6］3-溶液 1 mL，在波长500～900 nm范围内测定A，以检测波长为横坐标，A为纵坐标，绘制催化体系吸收光谱曲线。同时建立空白体系（不加青霉素和β-内酰胺酶）及非催化体系（不加β-内酰胺酶）。

1.5.2 Fe3+硫酸溶液体积的确定 将青霉素溶液与不同体积的 Fe3+硫酸溶液（0、1、2、3、4、5、6 mL）混合，100℃水浴20 min；水流冲洗冷却，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液 5 mL，［Fe（CN）6］3-溶液 1 mL，在波长680 nm处测定A。

1.5.3 ［Fe（CN）6］3-体积的确定 将青霉素溶液与5 mL Fe3+硫酸溶液混合，100℃水浴20 min；水流冲洗冷却，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液5 mL及不同体积的［Fe（CN）6］3-溶液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mL），在波长680 nm处测定A。

1.5.4 显色反应温度及时间的确定 将青霉素溶液与5 mL Fe3+硫酸溶液混合，分别于不同温度（50、70、100 ℃）水浴不同时间（0～60 min）；水流冲洗冷却，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液 5 mL，［Fe（CN）6］3-溶液1 mL，在波长680 nm处测定A。

1.5.5 显色反应pH的确定 将青霉素溶液与5 mL Fe3+硫酸溶液混合，用0.1 mol／L氢氧化钠和0.1 mol／L盐酸将混合液pH分别调节为0.3～9.0，100 ℃水浴 20 min；水流冲洗冷却，加入［Fe（CN）6］3-溶液1 mL，在波长680 nm处测定A。

1.5.6 酶促反应时间的确定 将青霉素溶液与4.00 mL β-内酰胺酶标准溶液混合，于37℃水浴不同时间（1、2、3、4、5、7、9、11、13、15、17 min），加入 5 mL Fe3+硫酸溶液，100℃水浴20 min；水流冲洗冷却，加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液 5 mL，［Fe（CN）6］3-溶液 1 mL，在波长680 nm处测定A。同时建立非催化体系（不加β-内酰胺酶标准溶液）。

1.6 方法的验证

1.6.1 专属性 取800 U／mL青霉素溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分别加入 5 mL 的0.01 mol／L Fe3+硫酸溶液（青霉素体系），采用优化方法进行检测；另取相同体积的青霉素溶液，加入β-内酰胺酶标准液30.00 mL，30℃水浴30 min，其他步骤同上（青霉素酶催化水解体系）；另取相同体积的青霉素溶液，加入2 mol／L的氢氧化钠溶10 mL，100℃水浴30 min；用2 mol／L盐酸调节pH至8.7，其他步骤同上（青霉素碱水解体系）。

1.6.2 线性范围 取5 mL的800 U／mL青霉素溶液，分别加入 β-内酰胺酶标准溶液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，即 β-内酰胺酶含量为 0、4、8、12、16、20、24 U／mL，采用优化条件测定 A。以 β-内酰胺酶含量为横坐标，ΔA为纵坐标，绘制标准曲线。

1.6.3 最低检出限 取5 mL的800 U／mL青霉素溶液，不加β-内酰胺酶标准溶液，平行测定非催化体系10次，计算标准偏差（s），结合标准曲线方程，计算检测限。

1.6.4 准确性 取1.00 g脱脂奶粉，加入5.0 mL水，混匀，超声振荡溶解10 min；加入丙酮定容10 mL，251.5×g离心5 min，取2.50 mL上清液，用蒸馏水定容至25 mL，备用。取脱脂奶粉样品3份，分别加入 300、400、500 U／mL 的 β-内酰胺酶，按优化方法检测酶含量，并按下式计算回收率。

回收率（%）=检出酶含量／（加标前酶浓度+加标量）×100%

1.7 方法的初步应用 取5.00 g鲜牛奶，加入丙酮，混匀，定容10 mL，于4℃，251.5×g离心5 min，取2.50 mL上清液，用蒸馏水定容25 mL。取鲜牛奶样品 3 份，分别加入 125、250、375 U／mL 的 β-内酰胺酶标准溶液，即终浓度为5、10、15 U／mL，取2.00 mL，采用优化方法进行测定。

2 结果

2.1 方法的优化

2.1.1 最适吸收波长 空白体系不显色，无特征吸收；非催化体系于680 nm波长处有强吸收；酶催化体系吸光度下降，见图1。因此确定以680 nm作为测定波长。

图1 吸收波长的确定Fig.1 Optimization of absorption wavelength

2.1.2 最适Fe3+硫酸溶液用量 Fe3+硫酸溶液在0～2 mL范围内与A680存在良好线性关系，>3 mL时，A680趋于恒定；>5 mL时，A680减小，这是由于大量过剩 Fe3+与普鲁士蓝 KFeⅢ［FeⅡ（CN）6］结构中［Fe（CN）6］4-发生了二次反应。见图2。为减少酶催化体系的测量误差，确保非催化体系青霉素的完全反应，确定Fe3+硫酸溶液用量为5 mL。

图2 Fe3+硫酸溶液用量对检测结果的影响Fig.2 Influence of volume of sulfuric acid solution containing trivalent ferric ion on determination result

2.1.3 最适［Fe（CN）6］3-溶液用量 ［Fe（CN）6］3-溶液>0.8 mL时，体系A680达最大，且保持恒定不变，见图 3。为确保 Fe2-完全反应，确定最适［Fe（CN）6］3-溶液用量为1 mL。

图3 ［Fe（CN）6］3-溶液用量对检测结果的影响Fig.3 Influence of［Fe（CN）6］3-volume on determination result

2.1.4 显色反应温度及时间 100℃水浴20 min时，A680达最大，见图4。因此，确定最适水浴温度为100℃，加热时间为20 min。

图4 不同反应温度及时间对检测结果的影响Fig.4 Influence of temperature and time for reaction on determination result

2.1.5 最适显色反应pH pH为3～5时，A680达最大；pH<3 时，A680减小；pH>7.5 时，加热促使Fe3+水解，出现 Fe（OH）3褐色沉淀，A680减小。见图 5。因此选择pH 4.5为最适显色反应pH。

图5 显色反应pH对检测结果的影响Fig.5 Influence of pH value for color reaction on determination result

2.1.6 最适酶促反应时间 在0～13 min内，△A逐渐增大，13 min时ΔA达最大，随后趋于恒定，见图6。因此确定最适酶促反应时间为15 min。

图6 酶促反应时间对检测结果的影响Fig.6 Influence of time for enzymatic reaction on determination result

2.2 方法的验证

2.2.1 专属性 青霉素酶催化水解体系及青霉素碱水解体系均未与Fe3+发生反应，仅青霉素体系可与Fe3+发生反应，见图7。青霉素酶催化水解产物和青霉素碱水解产物同为青霉噻唑酸，与Fe3+均不发生反应，Fe3+与青霉素反应具有唯一性。

图7 青霉素及青霉素水解产物与Fe3+反应的对比Fig.7 Comparison of reaction of penicillin and penicillin hydrolysates with trivalent ferric ion

2.2.2 线性范围 β-内酰胺酶标准曲线见图8。β-内酰胺酶在4～24 U／mL范围内与△A呈良好的线性关系，回归方程为：y=0.091 7 E x-0.512 0，相关系数（r）=0.998 9，根据青霉素反应量和反应液吸光度求得表观摩尔吸光系数（ε）＝5.46×104L／（mol·cm）。

图8 β-内酰胺酶的标准曲线Fig.8 Standard curve for β-lactamase

2.2.3最低检出限 平行测定非催化体系10次的s为0.012，最低检测限为0.32 U／mL。

2.2.4 准确性 加入300、400、500 U／mL的 β-内酰胺酶的3份脱脂奶粉样品的酶浓度分别为215、267、332 U／mL，RSD<1.50%，加标回收率在98.8%～101.2%范围内，见表1。表明该方法具有良好的准确性。

表1 准确性验证结果（x，n=6）Tab.1 Result of verification test for accuracy（x，n=6）

2.3 方法的初步应用 加入 5、10、15 U／mL β-内酰胺酶标准溶液样品的测定值分别为4.80、9.73、16.1 U／mL，与理论值较接近，相对误差分别为-4.0、-2.7、7.3。表明新鲜牛奶中不存在β-内酰胺酶，同时也表明牛奶中其他物质不影响β-内酰胺酶残留的测定。

3 讨论

目前，用于检测牛奶及奶制品中β-内酰胺酶含量较为成熟的方法有微生物培养法和碘量法。微生物培养法灵敏性高，但测定周期较长；碘量法方法简单，不适用于微量分析。本实验建立了牛奶中β-内酰胺酶含量的普鲁士蓝检测方法，经优化后，最适检测条件为：检测波长680 nm，Fe3+体积5 mL，［Fe（CN）6］3-体积 1 mL，显色反应水浴温度 100 ℃，加热时间20 min，显色反应pH 4.5，酶促反应时间15 min。

由于青霉素酶催化水解产物和青霉素碱水解产物同为青霉噻唑酸［7］，青霉素水解产物青霉噻唑酸与Fe3+均不发生反应。本实验结果表明，青霉素酶催化水解体系及青霉素碱水解体系均未与Fe3+发生反应，仅青霉素体系可与Fe3+发生反应，表明Fe3+与青霉素反应具有唯一性。β-内酰胺酶在4～24 U／mL范围内与ΔA呈良好的线性关系，回归方程为：y=0.0917Ex-0.5120，r=0.9989，检出限为 0.32U／mL，明显优于前期报道的 pH 法（15和 8.29 U／mL）［9-10］。加标试验结果表明，加标回收率在98.8%～101.2%范围，表明本实验建立的方法准确性良好。

采用优化方法对新鲜牛奶样品进行检测，测定值与理论值较接近，相对误差在-4.0～7.3范围内，表明新鲜牛奶中不存在β-内酰胺酶，也表明牛奶中其他物质不影响β-内酰胺酶残留的测定。综上所述，本实验建立的方法具有良好的线性及准确性，且简便、省时，可用于牛奶及奶制品中β-内酰胺酶含量的检测。