CD1d融合蛋白的表达及其在自然杀伤T细胞原代培养中的作用

刘计荣，赵冰，韩化敏

1.华北电力大学医院，北京 102206；2.拜西欧斯（北京）生物技术有限公司，北京 100070

自然杀伤 T（natural killing T，NKT）细胞是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群［1］。NKT细胞能表达T细胞的TCR及NK细胞的NKR-P1两种受体，特别是NKT细胞多数表达Va14 TCR，识别CD1抗原，而NKR-P1识别各种糖链。绝大多数NKT细胞仅能识别由CD1d分子递呈的特异性糖脂类分子，而不能识别由主要组织相容性复合物（MHC）递呈的多肽［2］。NKT细胞表面的TCRαβ链，使得NKT细胞特异性识别由CD1d分子呈递的脂类或糖脂类抗原，其中α-GalCer通过与CD1d特异性结合，而CD1d又与TCR连接形成三联体复合体，将α-GalCer抗原递呈给Ⅰ型NKT细胞，激活的NKT细胞具有直接杀瘤效应，并进一步活化NK细胞，促进其杀瘤效应；α-GalCer激活的Ⅰ型NKT细胞可促进树突状细胞分泌IL-12，从而增强抗瘤效应；活化后的NKT细胞能够快速、大量分泌Th1、Th2型细胞因子，从而强有力地影响免疫反应类型，实现对免疫应答的调控。

目前，多项自体NKT细胞治疗肿瘤的临床试验 已注册进行（NCT01801801852，NCT02619058，NCT03093688）。张明徽［3］表示，将 NKT 特异性扩增后回输治疗，或采用激动药物将患者体内的NKT激活，可能会达到彻底压制肿瘤的目标。已有早期肝癌和胃癌转移患者仅依靠该项技术，无病存活超过3年。如何在体外获得足够量、有活性的NKT细胞是成功进行NKT细胞过继性免疫的关键。但由于NKT细胞在外周血数量有限，扩增效率低，难以获得足够治疗剂量的细胞数量。已知在NKT细胞激活过程中，CD1d和α-GalCer的作用不可代替。α-GalCer作为Ⅰ型NKT细胞的特异性激动剂，可用于在体内外活化并大量扩增Ⅰ型NKT细胞。自然情况下，CD1d与β2微球蛋白形成异源二聚体，通过将表达CD1d与hIgG1的基因连接，原核或真核表达重组蛋白，并借助hIgG1自身的二硫键形成二聚体，该重组蛋白负载α-GalCer后可作为诱导扩增NKT细胞的方法。另外，还可利用α-GalCer／CD1d四聚体作为Ⅰ型NKT细胞的检测工具。

本研究构建了一种CD1d／hIgG1重组蛋白，该重组蛋白在设计上除了可作为人工的抗原提呈细胞促进Ⅰ型NKT细胞的激活和扩增外，还加入了生物素化标签，可与链霉亲和素磁珠结合，起到富集Ⅰ型NKT细胞以及固相刺激的作用。通过RT-PCR获得编码CD1d蛋白和β2微球蛋白的cDNA，添加相应的酶切位点及标签后，将目的基因插入至表达载体中构建重组质粒，将重组质粒转入CHO-K1细胞建立稳定表达CD1d融合蛋白的细胞系，持续获得大量纯化重组蛋白，同时筛选出CD1d融合蛋白和α-GalCer的最佳添加剂量，进行NKT细胞培养。

1 材料与方法

1.1 外周血 由年满18周岁健康志愿者捐献，常规项目检查均正常，所有志愿者均签署知情同意书。

1.2 质粒、细胞及菌株 pcDNA3.1（-）载体购自美国Invitrogen公司；中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1细胞）及293T细胞购自协和医院细胞库；linker-BriA tag基因质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成并提供；hIgG1基因质粒和大肠埃希菌（E.coli）DH5α 由拜西欧斯（北京）生物技术有限公司研发实验室保存并提供。

1.3 主要试剂及仪器 Trizol试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶XbaⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和T4 DNA连接酶购自美国NEB公司；DNA marker、逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、转染试剂购自日本TaKaRa公司；兔抗人CD1d抗体购自美国Abcam公司；HRP标记的山羊抗人IgG购自北京索莱宝科技有限公司；BirA生物素蛋白连接酶标准反应试剂盒购自美国AVIDITY公司；Bio-Rad凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；Protien A柱购自美国GE公司；PCR仪购自北京东胜创新生物科技有限公司。

1.4 引物设计及合成 根据GenBank-CD1d（No.NM210766）的功能编码区序列和载体pcDNA3.1（-）序列的特点，选择XbaⅠ和BamHⅠ作为限制性内切酶，应用Primer Premier 5.0软件设计上下游引物。Primer1：5′-gtctagaatg tctcgctccg tggccttagc tgtg-3′；Pimer2 R：5′-ctccgccaga tccgccacct ccgtctcgat cccacttaac tatc-3′；Primer3 R：5′-cgggatccgc cgccacccga gccacctccg ccagatccgc cacctcc-3′；Primer4 F：5′-cgggatccgtcccgcaaaggcttttcc-3′；Primer5 R：5′-gaggatggat cgga-ggtgta gctccc-3′；Primer6 F：5′-ctacacctcc gatccatcct ctagagtc-3′；Primer7 R：5′-cccccaccac ctttacccgg agacagg-3′；Primer8 F：5′-ccgggtaaag gtggtggggg ttcgggc-3′；Primer9 R：5′-ggaagctttt agtgccattc gattttttgt gcttcgaaga tgtcgttgag gcccg-3′。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 重组质粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag的构建 分离外周血PBMC，Trizol试剂提取RNA，反转录为cDNA，以其为模板，利用引物Primer1／Primer2进行第一轮扩增（扩增条件：94℃30 s，55℃30 s，72 ℃ 75 s，33 个循环；72 ℃ 10 min）；以第一轮扩增产物为模板，利用引物Primer1／Primer3进行第二轮扩增，获得片段 β2M+（G4S）3；以 cDNA 为模板，利用引物Primer4／Primer5进行扩增，获得CD1d基因；以hIgG1基因质粒为模板，利用引物Primer6／Primer7进行扩增，获得hIgG1片段；以linker-BriA tag基因质粒为模板，利用引物Primer8／Primer9进行扩增，获得linker-BriA tag片段；将hIgG1片段与linker-BriA tag片段混合，利用引物Primer6／Primer9进行overlap扩增，获得hIgG1+linker-BriA tag；将CD1d基因片段与hIgG1+linker-BriA tag片段混合，利用引物Primer4／Primer9进行overlap扩增，获得CD1d+hIgG1+linker-BriA tag；XbaⅠ、HindⅢ酶切pcDNA3.1（-）及 XbaⅠ、BamHⅠ酶切 β2M+（G4S）3，BamHⅠ、HindⅢ酶切 CD1d+hIgG1+linker-BriA tag，将酶切产物 pcDNA3.1（-）、β2M+（G4S）3 与CD1d+hIgG1+linker-BriA tag用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化 E.coli DH5α，涂布含 100 μg／mL氨苄青霉素平板，进行克隆筛选，XbaⅠ和BamHⅠ酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag，鉴定正确的质粒送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.6 稳定表达细胞株的筛选 将CHO-K1细胞用含10%FBS的F12K培养基培养，至细胞融合度达80%时，采用磷酸钙转染法，转染质粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag，G418筛选转染成功细胞株，接种至96孔板，每孔不超过1个细胞，进行扩增，37℃，5% CO2培养箱中进行培养。收集上清进行6%琼脂糖凝胶电泳鉴定及Western blot分析。将稳定表达CD1d蛋白的CHO-K1细胞系扩增培养，取细胞培养液上清，超滤离心获得超滤浓缩液（约30 mL），0.45 μm 滤膜过滤，用 Protien A 柱纯化，ELISA法检测表达量。将纯化后获得的CD1d蛋白按照BirA生物素蛋白连接酶标准反应试剂盒说明书进行蛋白生物素化，同时进行Western blot分析。

1.7 Western blot分析 取样品经8%SDS-PAGE分离，上样量均为20 μL，预染蛋白质marker上样量为5 μL。浓缩胶电泳条件为80 V，45 min，分离胶电泳条件为120 V，45 min。电泳结束后转膜，4～6℃，200 mA约2 h；封闭液（8%脱脂牛奶）37℃封闭2 h或4℃过夜；PBST洗涤1次，加入CD1d抗体（1∶1 000稀释）作为一抗，4℃过夜；加入HRP标记的山羊抗人IgG（1∶2 000稀释）作为二抗，脱色摇床室温振荡1 h；PBST洗涤3次，每次10 min，DAB试剂避光显色5～10 min，加入蒸馏水终止反应。用Bio-Rad凝胶成像系统进行拍照。

1.8 重组 pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag 质粒的真核表达 试验分为3组：pcDNA3.1（-）空载体组、293T 细胞组、质粒 pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag转染组。收集各组细胞培养液上清进行Western blot分析，方法同1.7项。

1.9 hIgG1-BriA tag蛋白对NKT细胞体外扩增影响的检测 采用流式细胞术。取分离的PBMC进行NKT细胞培养，试验分为2组：hIgG1-BriA tag组，在PBMC培养过程中加入hIgG1-BriA tag蛋白、α-Galcer糖及CD3抗体；对照组，仅加入CD3抗体。Beckmancyto FLEX流式细胞仪对培养细胞进行分析，采用 anti-CD3-FITC、anti-CD56-PE、anti-CD8-APC（ebiosicense）三种荧光通道，同型对照抗体确定散点门的未知及检测电压，并调节补偿。

2 结果

2.1 目的基因的鉴定 扩增产物CD1d-hIgG1-BriA tag经8%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 862 bp的特异性片段，见图1。

图1 CD1d+hIgG1+BriA tag扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of CD1d+hIgG1+BriA tag

2.2 重组质粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag的鉴定 质粒的双酶切（XbaⅠ／BamHⅠ）产物经8%琼脂糖凝胶电泳分析，pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA 3个重组质粒均分别可见399、800和6 411 bp的特异性条带，大小与预期相符，见图2；质粒的双酶切（HindⅢ／BamHⅠ）产物经8%琼脂糖凝胶电泳分析，pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA 3 个重组质粒均分别可见1 871和5 800 bp的特异性条带，大小与预期相符，见图3。证明3个重组质粒均构建成功。

图2 CD1d基因3个重组质粒的双酶切（XbaⅠ／BamHⅠ）产物电泳图Fig.2 Restriction map of three recombinant vectors for CD1d gene（XbaⅠ／BamHⅠ）

图3 CD1d基因3个重组质粒的双酶切（HindⅢ／BamHⅠ）产物电泳图Fig.3 Restriction map of three recombinant vectors for CD1d gene（HindⅢ／BamHⅠ）

2.3 pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag稳定表达细胞株的筛选及鉴定 9号CHO-K1细胞株（泳道5）可表达CD1d融合蛋白，大小与预期相符，见图4；培养上清浓缩液经Protien A柱纯化，纯化后CD1d融合蛋白相对分子质量大小与预期相符，见图5；ELISA结果显示，转染重组载体的CHO-K1细胞培养液上清样品（编号 1～10）A280值分别为 0.073、0.098、0.093、0.082、0.090、0.076、0.106、0.088、0.187和0.107），未转染重组质粒的CHO-K1细胞培养液上清样品（阴性对照）A280值为0.130，9号CHO-K1细胞株纯化后CD1d蛋白样品（编号9-1～4）A280值分别为 3.781、3.259、3.519 和3.717，其中，9号CHOK1细胞培养液上清A280值最高，经纯化A280增加约19倍。纯化的CD1d融合蛋白先进行生物素化，再进行Western blot分析，相对分子质量大小与预期相符，见图6。表明9号细胞株为表达CD1d蛋白的稳定细胞株。

图4 质粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag转染CHOK1细胞表达的CD1d融合蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blotting of CD1d fusion protein expressed in CHO-K1 cells transfected with plasmid pcDNA3.1（-）-CD1dhIgG1-BriA tag

图5 9号转染细胞培养上清纯化后产物的Western blot分析Fig.5 Western blotting of purified protein expressed in clone 9 of transfected cells

图6 经生物素化的纯化的CD1d融合蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blotting of purified CD1d fusion protein after biotinylation

2.4 重组CD1d-hIgG1-BriAtag蛋白的鉴定 Western blot分析显示，该融合蛋白的二聚体大小处可见明显条带，见图7。证明构建的重组质粒pcDNA3.1（-）-CD1d-hIgG1-BriA tag可在293T细胞中正确表达。

图7 CD1d蛋白表达水平的Western blot分析Fig.7 Determination of expression level of CD1d protein by Western blot

2.5 CD1d-hIgG1-BriA tag对NKT细胞体外扩增的影响 培养第8天，hIgG1-BriA tag组出现明显的细胞增殖，成团簇细胞出现，见图8；流式细胞术分析显示，与对照组（2.31%）相比，CD3+CD56+NKT细胞由培养前的0.30%扩增至4.99%，显著增加，提示CD1d-hIgG1-BriA tag融合蛋白对NKT细胞具有刺激作用，见图9。

图8 CD1d-hIgG1-BriA tag融合蛋白作用下培养不同天数的PBMC的显微镜观察（×200）Fig.8 Microscopy of PBMCs cultured for various days after treatment with CD1d-hIgG1-BriA tag（× 200）

图9 两组细胞不同培养时间CD3+CD56+NKT流式细胞仪计数细胞的比较Fig.9 Flow cytometry of CD3+CD56+NKT cells cultured for various days in two groups

3 讨论

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的主要疾病之一。手术、放疗、化疗是肿瘤治疗的传统手段［4］，免疫治疗目前已成为治疗肿瘤的第四种手段，而且是最有效的手段之一。通过采集患者自身免疫细胞，经体外培养扩增，再回输至患者体内以杀灭癌细胞、病原体，激活人体免疫能力，从而预防肿瘤复发和转移，可在一定程度上解决患者放化疗后免疫力差、生活质量下降的弊端。细胞免疫疗法在国际上已逐渐成为治疗癌症的新趋势，2011年世界顶级期刊《自然》发文提出“免疫治疗的时代已经到来”［5］。

目前用于细胞免疫治疗的主要有高纯度树突状细胞DC、CIK、NK细胞、CD3抗体激活的杀伤细胞（CD3AK）、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和NKT细胞。NKT细胞是从人外周血或脐带血经体外分离获得单个核细胞，经刺激后连续培养获得，是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一［6］。NKT细胞是不同于T、B淋巴细胞的第三类淋巴细胞，能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，特别是NKT细胞多数表达Va14TCR，识别CD1抗原，而NKR-P1识别各种糖链。NKT细胞仅能识别CD1d分子提呈的脂类、蛋白质抗原［7］，在这些抗原的刺激下，NKT细胞不仅是IL-4和IFNγ的强力产生细胞，同时参与Th1／Th2分化的抑制，其主要生物学功能包括免疫调节和细胞毒作用，可直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞，因此在机体抗肿瘤、早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫应答中起重要作用。

NKT细胞在人体内普遍存在，即使在肿瘤患者体内也存在具有效应作用的NKT细胞，且NKT细胞对肿瘤细胞的识别不受MHC表型的限制。因此，α-GalCer／CD1d-NKT系统可能成为人肿瘤免疫治疗中新的有效方法。

NKT细胞的激活不仅可直接发挥抗肿瘤免疫作用、间接激活多种免疫细胞，还可激活衰竭的CD8+T细胞和NK细胞，从而快速、持久地增强抗肿瘤活性。因此，NKT细胞免疫治疗是目前对免疫治疗耐药癌症患者的一个良好的选择［8］。

既往NKT细胞在临床抗肿瘤治疗中作用的研究主要集中在将NKT细胞配体α-GalCer用于激活癌症患者NKT细胞发挥抗肿瘤作用［9-10］，对于NKT细胞唯一识别的递呈抗原分子CD1d研究较少，因此本研究体外成功重组了刺激NKT细胞活化的CD1d-hIgG1融合蛋白，并验证在体外用该蛋白刺激NKT细胞的增殖。由于NKT细胞比例较低，影响了扩增效果，下一步将对PBMC进行NKT细胞的磁珠分选纯化，并将CD1d-hIgG1融合蛋白／链霉亲和素磁珠作为固相再进行扩增，并对培养条件，如培养基、细胞因子、添加物及CD1d-hIgG1融合蛋白用量进行优化，为NKT细胞免疫治疗提供了一种体外刺激活化免疫细胞的选择。