盐度对厌氧氨氧化脱氮性能及微生物群落的影响

李南锟， 杜 帅， 张培培， 刘 莉， 罗 娟

(1.生态环境部环境工程评估中心， 北京 100012； 2.北京国电富通科技发展有限责任公司， 北京 100070； 3.生态环境部环境规划院， 北京 100012； 4.清华大学， 北京 100091)

厌氧氨氧化过程是在厌氧氨氧化菌作用下将氨氮和亚硝氮直接转化为氮气释放并产生少量硝氮的过程[1]。厌氧氨氧化微生物反应过程中，无需外加碳源，无需曝气，而且由于产泥量极低，脱氮效率较高等优势被称为本世纪最具有前景的脱氮工艺之一，并逐步开始应用于各类复杂的污水处理中[2]。其中，高盐废水的脱氮处理就是其中备受关注的方向[3]。废水中总溶解固体(TDS)和有机物的质量分数大于3.5%或总含盐量(以NaCl的质量分数计)大于等于1%即为高盐废水[4]。我国水资源时空分布严重失衡，淡水资源紧缺，由于人口众多，导致人均淡水资源量较低，仅为世界平均水平的1/4，因此，从这个角度看，中国已是世界上最缺水的国家之一[5]。为了应对我国的淡水资源危机，许多沿海城市使用海水代替淡水以满足生活和生产活动的需要，比如用作冲厕水、中水、消防用水等，此外，炼油、造纸、化肥、焦化以及食品等工业用水和农业产生废水具有水量大，含盐高、碳氮比低、部分有毒性等特点[6]。对于高盐废水的处理，传统的微生物脱氮以及物理化学方法具有成本高，效率低，难度大等劣势[7]。

大部分厌氧氨氧化菌株提取自海水，因此对高氨氮、高盐度废水的处理具有天然的优势[8]。而且厌氧氨氧化过程完全自养，无需额外曝气，无二次污染，脱氮效率高，近年来逐步应用于工业废水，农业废水和垃圾渗滤液等高盐度废水的脱氮应用中，成为当前研究的热点[9]。以往学者研究显示，盐度30 g·L-1NaCl为盐度的分水岭，盐度低于此值时，氮元素去除率均能维持在80%以上；高于30 g·L-1时，脱氮效率急剧下降[10-12]。此外，在30 g·L-1的NaCl高盐废水下同时驯化Scalindua和Kuenenia的两种厌氧氨氧化菌种实验中，Kartal[13]等发现，Kuenenia在驯化后最终成为脱氮系统中的优势菌种。综上可知，部分厌氧氨氧化菌种在高盐度的废水中仍旧能保持较高的活性，对高盐度、高氨氮废水有突出的优势，因此，对厌氧氨氧化系统在高盐环境下脱氮性能及微生物多样性和群落结构的深度分析具有较大意义。

本研究中，在稳定运行半年的颗粒化厌氧氨氧化污泥系统中，通过依次加入10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl进行盐度对系统影响实验。基于高通量测序技术，研究了高盐度对厌氧氨氧化系统的脱氮性能及微生物群落的冲击和影响，为后续高盐低碳废水脱氮的生物处理提供了新的见解。

1 材料与方法

1.1 实验装置

采用水流自下而上天然厌氧的UASB反应器，有机玻璃材质，内径5 cm，高80 cm，有效容积1.5 L，较大的高径比有利于厌氧氨氧化颗粒的进一步形成和强化。具体见图1。

1.进水桶； 2.NaOH溶液； 3.三相分离装置； 4.出水堰； 5.取样口； 6.出水桶。图1 反应器示意图

1.2 接种污泥与实验用水

实验进水采用人工配水，以NaCl为主要的盐度来源，以NaNO2和NH4Cl为氮源，其他组分包括NaHCO31000 mg·L-1，MgSO4·7H2O 100 mg·L-1，KH2PO430 mg·L-1，CaCl27.8 mg·L-1。微量元素1 mL·L-1微量元素成分：EDTA 5000 mg·L-1，MnCl2·4H2O 990 mg·L-1，CuSO4·5H2O 250 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 430 mg·L-1，CoCl2·6H2O 240 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 220 mg·L-1，NiCl2·6H2O 190 mg·L-1，H3BO414 mg·L-1[14-15]。

1.3 测试项目与方法

在系统进水中分别加入10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl，每个浓度梯度运行稳定后，在反应器取样口提取3个平行微生物样品，离心后冷冻储存在-20℃冰箱中，3个盐度浓度梯度分别标记为A，B，C3组，每组3个平行样品以A组为例，标记为A1，A2，A3，以此类推。取样完成后，所有样本做好标记，委托美吉生物公司测序平台对所有样品进行微生物测序统计。本批样品均采用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)作为引物,对V3～V4高变区域16S rRNA序列进行扩增分析.MiSeq文库构建和测序数据存于美吉生物测序公司i-sanger云平台。

2 结果与讨论

2.1 实验进程

2.2 盐度对系统氨氮去除率的影响分析

图2 不同盐浓度下厌氧氨氧化系统对氨氮的转化效能

2.3 盐度对系统亚硝氮去除率的影响分析

当然，针对氨氮和亚硝态氮去除率偏差过大的情况，一部分原因是厌氧氨氧化运行系统进水中存在一定的溶解氧，因此反应系统内部并不是完全的厌氧环境，所以，系统内部存在可以将氨氮氧化为亚硝态氮的氨氧化细菌，将部分氨氮转化为亚硝态氮，造成一定的亚硝态氮积累，使得氨氮去除率升高，亚硝态氮去除率降低，而造成了氨氮和亚硝态氮去除率偏差大的情况。

2.4 氨氮与亚硝氮转化量与硝氮生成量的分析

Strous[21]等通过大量的实验数据和计算，确立了厌氧氨氧化反应的氮素之间关系如下所示：

图3 不同盐浓度下厌氧氨氧化系统对亚硝氮的转化效能

因此，按理论值计算，亚硝氮和氨氮转化率之比为1.32，硝氮生成量与亚硝氮转化量之比为0.26。

图4 氨氮、亚硝氮转化量与硝氮生成量关系比较

2.5 系统微生物多样性及丰富度分析

微生物多样性和丰富度统计表1中可见，各阶段的送检样品覆盖度均大于0.99，说明测序结果具有参考价值。Ace指数和Chao指数[24]均是用来估算样本中所含OTU数目的指数，两者采用的算法不同，但指数数值都与物种的丰富度成正比。由表1可知，Ace指数和Chao指数相互印证，说明随着进水盐度的增加，厌氧氨氧化系统中物种的种类和丰富度明显下降，充分体现出部分菌种不能在高盐度的水环境下生存。

表1 微生物群落丰度和多样性

Shannon指数[25]和Simpson指数[26]分别为微生物的多样性的正比指数与反比指数。本研究中Shannon指数值随盐度上升明显下降，而Simpson指数值却为上升趋势，二者均是对上述物种丰富度减少原因的印证，说明盐度对部分微生物有明显的抑制作用导致系统中微生物物种多样性减少。

2.6 微生物门分类水平分析

系统中微生物的种类和相对丰度决定了系统的功能，因此，不同分类水平下对样本中微生物种类和丰度的分析，对系统功能的解读具有重要的意义[27]。如图5门水平群落分布图所示，在厌氧氨氧化UASB反应器分阶段所取微生物样品中，浮霉菌门(Planctomycetes)是相对丰富度最大的菌门，然后依次为绿弯菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。其中，经研究确定的厌氧氨氧化菌种所在的浮霉菌门(Planctomycetes)在盐度不断增加的驯化实验中，丰度不断增加，由最初 28.23%增长到 45.22%，物种相对丰度占比不断提升，说明此类菌种可以在高盐度的环境下依旧保持较高的活性和脱氮效率。此外，通过传统的硝化反硝化方式脱氮的菌属所在的变形菌门(Proteobacteria)[28～29]和厌氧氨氧化系统中对污泥颗粒化和反应器中生物膜形成的重要作用的绿弯菌门(Chloroflexi)的相对丰度呈现下降趋势[30]。而拟杆菌门(Bacteroidetes)随着盐度浓度不断的提升，物种相对丰度有阶梯式的提高，可能此菌门中存在某些菌属可以极好的适应高盐度的水环境，在高盐厌氧系统的脱氮中扮演着重要的角色。

(A1～A3，B1～B3,C1～C3分别为添加10 g·L-1,20 g·L-1,30 g·L-1的NaCl盐度环境下采集的3组平行微生物样品)图5 系统门水平群落分布图

2.7 微生物属分类水平分析

为了深入研究盐度对系统中微生物群落的影响，绘制了属水平群落分布图以及Wilcoxon rank-sum检测条形图，进一步对比随着盐度的增加微生物物种和相对丰度的变化情况。

从图6中可知，Candidatus_Kuenenia相对丰度达到31.6%，是厌氧氨氧化系统中占比最高的菌属，对系统的脱氮性能有决定性作用。由图可知，随着进水盐度浓度的变化，Candidatus_Kuenenia的物种相对丰度从31.6%下降到27.1%。相较于Jiang[31]等在厌氧氨氧化MVR系统的实验中得出，

(A1～A3，B1～B3,C1～C3分别为添加10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl盐度环境下采集的3组平行微生物样品)图6 系统属水平群落分布图

当系统盐度从0 g·L-1提升到30 g·L-1时Candidatus_Kuenenia菌属从相对丰度占比从72.7%下降到13.5%的结果，可知厌氧氨氧化颗粒污泥系统对高盐水环境有更好的抗冲击能力。g_norank_f_Anaerolineaceae菌属是厌氧氨氧化系统中绿弯菌门(Chloroflexi)最常见的菌属，其通常存在于厌氧环境中，与氢营养型产甲烷菌协同降解系统中碳水化合物和其他细胞组织[32]。

Denitratisoma菌属属于变形菌门(Proteobacteria)一直保持着较高的丰度，是厌氧氨氧化系统脱氮性能的重要辅助成分。 SM1A02菌属于浮霉菌门(Planctomycetes)，在ANAMMOX反应器中普遍存在且相对丰度占比较大[33-34]。有文献研究称，SM1A02属是活性污泥中的功能性细菌属，被称作潜在的新型厌氧氨氧化菌属[35]。此外，norank_c_Chitinivibrionia在盐度达到20 g·L-1时便从该系统中消失。在盐度提升到20 g·L-1时Arenimonas菌属的相对丰富度提升到最高，但是当盐度提升到30 g·L-1，Arenimonas菌属相对丰度急剧减少几近消失，不同的是Chryseolinea菌属随盐度升高，丰度不断提高。

图7为属水平Wilcoxon rank-sum检测条形图，图中可以清楚地看出各样本不同分组组中的平均相对丰度百分比的差值，最右边为P值，P值越小，表示物种的变化越大。图中可以清晰地看出norank_c_Chitinivibrionia和Arenimonas随盐度的提升，丰度出现明显下降，这两种菌属均为专性厌氧，异养菌属，其中Arenimonas为异养反硝化菌属[36-38]。Chryseolinea丰度随盐度的提升而不断升高，以往文献中提到此菌属是影响污泥沉降性能的关键菌属，极易在厌氧环境下生存，有利于厌氧氨氧化颗粒的生成[39]。

(A,B,C分别为添加10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl盐度环境下采集微生物样品)图7 属水平Wilcoxon rank-sum检测条形图

3 结论

(1)通过逐步加入10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl对颗粒厌氧氨氧化污泥系统进行盐度影响探究。结果发现:盐度从0 g·L-1增加到30 g·L-1过程中对氨氮去除率几乎没有影响，对亚硝氮去除率影响较大，亚硝氮去除率从95%降到65%。

(2)16SrRNA基因高通量测序分析研究结果显示从门水平分析，随着盐度的增加，浮霉菌门(Planctomycetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)丰度增加，而变形菌门(Proteobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi) 丰度减少。

(3)Candidatus_Kuenenia是厌氧氨氧化系统中占比最高的菌属，丰富度最高达到31.6%，是决定系统脱氮性能的主导菌属，盐度达到30 g·L-1时，其丰度下降至27.1%。潜在的Anammox菌属-SM1A02菌属随着盐度的提升，丰度占比有明显的提升，此外，norank_c_Chitinivibrionia，Arenimonas,Chryseolinea是受盐度影响相对丰度变化最大的3种菌属。