两种昆虫病原线虫在兰州的田间消长规律及越冬越夏观测

朱小芳，张晓波，钱秀娟

(甘肃农业大学植物保护学院,甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes，EPN)是指虫体内带有病原性共生细菌、能引起昆虫致病的一类线虫[1]，主要包括斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis).昆虫病原线虫具有寄主范围广、能主动搜寻寄主昆虫、可在侵染寄主后28～48 h内引起寄主昆虫死亡和对动植物和人类及生态环境安全等特点[2-3].昆虫病原线虫具有天敌昆虫兼病原微生物的双重特点，可部分替代化学杀虫剂[4-6].昆虫病原线虫对多种地下害虫控制效能较高，且具有一定的抵抗力，可以与一些杀虫剂混用来防治地下害虫的危害.作为一种高效安全且对环境友好的生防因子，昆虫病原线虫已成为害虫绿色防控中倍受重视和最具发展前景的高效生物杀虫剂之一[7].昆虫病原线虫对250多种隐蔽性害虫有控害作用[8-9]，在已描述的90多种昆虫病原线虫中，至少有12种已被商品化用于生物防治[10-11].因此，昆虫病原线虫不仅在各个领域被广泛用作生物杀虫剂，而且成为害虫持续控制的研究方向[12-13]；目前，全球约60多个国家的100多个实验室在开展昆虫病原线虫的研究，致力于这种新型生物杀虫剂的推广应用[7,14].

影响昆虫病原线虫防治效果的因素有环境条件、田间施用技术和线虫特性等，只有明确各因素的作用，才能充分发挥其控制害虫的潜力.其中，施用技术直接影响防治效果，田间施用位置越接近害虫，防治效果越佳[13].Serwe-Rodriguez等[15]研究表明，在环境胁迫下,虫尸剂(感染昆虫病原线虫的昆虫尸体)能够帮助昆虫病原线虫抵御不良环境.Bornstein-Forst等[16]对线虫S.carpocapsaeA10的研究结果表明,低温胁迫会对线虫在大蜡螟寄主体内的发育产生负面影响,其在低温条件下发育过程会停止,并且大蜡螟体内的的线虫会死亡很大一部分；同时,温度升高到适合线虫发育后,大蜡螟体内的线虫会发育成为侵染期线虫.Monteiro等[17]研究表明，与喷洒线虫悬浮液的施用方式相比,田间直接施用虫尸剂的防治效果更明显.如何使用虫尸剂对有害靶标昆虫进行高效防治,已经成为昆虫病原线虫应用研究的热点之一[18-19].

昆虫病原线虫对害虫的控制效果主要取决于其田间适应能力，尤其是其越冬越夏情况.昆虫病原线虫在大田环境下的种群消长情况及越冬越夏存活情况直接决定了线虫的使用频率和防治成本，对于利用线虫防治地下害虫的推广意义重大.因此，对于昆虫病原线虫越冬越夏能力的调查，能够更好地在生产实践中指导人们选择优良的方法进行害虫防治[20-21].

西北地区气候干旱，昼夜温差大，引进的昆虫病原线虫适应性差，为开发本地资源，谷黎娜对甘肃省内诱集的29个昆虫病原线虫品系进行了初步筛选[22].本试验以筛选出的2种侵染力较高的昆虫病原线虫异小杆线虫H.megidis0627M和斯氏线虫S.feltiae0619HT为研究对象，通过不同施用方法及施用剂量下斯氏线虫和异小杆线虫的越冬越夏及其分布情况(田间动态分布)的调查研究，以期筛选出昆虫病原线虫较好的施用方法，并为其在田间的大规模施用提供一定的理论支撑，为进一步研究和应用提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

大蜡螟(Galleriamellonella)5龄老熟幼虫由天津惠裕德生物科技有限公司提供，试验前经滞育处理以防止大蜡螟幼虫吐丝、结茧.

异小杆线虫H.megidis0627M和斯氏线虫S.feltiae0619HT由甘肃农业大学养虫室提供，贮存方法为低温保存线虫悬浮液，每2个月扩繁1次[23].

1.2 试验样地

甘肃兰州市位于N 36°03′,E 103°40′，年降水量为250～350 mm，属温带大陆性气候,年平均气温10.3 ℃.试验地为甘肃农业大学地下害虫研究试验用地，每块大小为1.2 m×0.6 m，田块之间以水泥隔开，且都以水泥封底，试验前对各田块土壤进行灭菌处理.在试验田内种上韭菜(模拟田间生长环境)，待韭菜长势良好时，在10块试验田内施入韭蛆(以纱网覆盖)，使韭蛆在田间建立种群.试验开始之前对这些田块的土壤进行了多次取样调查，均未得到昆虫病原线虫以及植物性寄生线虫和腐生线虫.

1.3 试验方法

1.3.1 昆虫病原线虫悬浮液和虫尸剂的获取及施用 本试验采用线虫悬浮液3×105、线虫悬浮液4×105、线虫悬浮液5×105、虫尸剂8头和线虫悬浮液3×105+虫尸剂8头五种的处理方法.

虫尸剂的获取：试验前8 d，选取体重基本一致(约0.35 g)的大蜡螟置于24孔板内，分别用斯氏线虫S.feltiae0619HT和异小杆线虫H.megidis0627M的侵染期线虫侵染大蜡螟，置于室温(25 ℃)下培养[24].并收集虫尸留用.

悬浮液的获取方法：在室温(25 ℃)下，用大蜡螟进行活体扩繁，并用White trap法收集侵染期线虫.收集得到的线虫悬浮液保存于4 ℃冰箱中，试验所用的线虫为新鲜培养.

线虫悬浮液及虫尸剂的施用：2018年10月，分别将异小杆线虫H.megidis0627M 和斯氏线虫S.feltiae0619HT的悬浮液喷洒施入试验地表层土壤、虫尸剂置于土表.之后覆盖一层薄土，以防止紫外线对昆虫病原线虫的影响[25].

1.3.2 昆虫病原线虫田间种群消长规律测定 每月统计试验地中昆虫病原线虫的种群数量.统计方法为五点取样法，采集深度分别为0～10、11～20、21～30 cm，每个土层分别采集100 g左右土壤样品，带回实验室.

采集后称取100 g土壤样品，加入500 mL水，用贝尔曼漏斗法分离线虫，获得的线虫悬浮液，摇匀后取45 mL悬浮液置于离心管中离心5 min(5 400 r/min)，弃去上清液40 mL，在体式显微镜下观察并统计昆虫病原线虫的数量.

1.2.3 越冬越夏情况调查 分别在越夏(6～8月)和越冬(12月和次年1～2月)时期每隔15 d进行1次昆虫病原线虫种群数量测定，了解昆虫病原线虫越冬越夏情况.

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 旱区昆虫病原线虫田间种群消长规律

研究结果表明，在施用后为期1 a的调查中，11月份以悬浮液3×105头+虫尸剂8头的施用方法施用后，2种昆虫病原线虫H.megidis0627M和S.feltiae0619HT均能在田间建立种群.之后H.megidis0627M和S.feltiae0619HT 2种品系线虫数量呈现上升趋势，12月份出现第1个峰值，说明线虫在田间定殖后进行了扩繁.1月份和2月份线虫数量均处于低谷，为线虫的越冬期；翌年4月份出现第2个峰值，因越冬代幼虫复苏后，再一次进行扩繁.此后，线虫种群数量出现平缓的下降趋势，但是种群数量与刚施入田间1月后的种群数量差异不显著(P>0.05).说明悬浮液+虫尸剂施用后，昆虫病原线虫H.megidis0627M和S.feltiae0619HT施入甘肃地区田间后，均能建植种群并定殖、安全越冬越夏.2种昆虫病原线虫H.megidis0627M和S.feltiae0619HT在1 a内的种群数量变化趋势一致，且在为期1 a的观察中，S.feltiae0619HT的田间种群数量显著高于H.megidis0627M(图1).

2.2 旱区昆虫病原线虫越冬观测

2.2.1 不同施用方法对越冬的影响 研究结果表明，在不同的施用方法下，昆虫病原线虫S.feltiae0619HT和H.megidis0627M越冬数量有差异，但均可安全越冬.以3×105悬浮液、4×105悬浮液、5×105悬浮液、虫尸剂8头和3×105悬浮液+虫尸剂8头施入后，在 11～20 cm土层中的S.feltiae0619HT的种群数量分别为896.45、904.27、953.64、821.44、1 296.28头，均高于0～10 cm和21～30 cm土层中的种群数量，且差异显著(P<0.05).且在11～20 cm土层中，3×105悬浮液+虫尸剂8头的施用方法下昆虫病原线虫S.feltiae0619HT的种群数量为1 296.28头，均高于其他施用方法，且差异显著(P<0.05)；以3×105悬浮液、4×105悬浮液、5×105悬浮液、虫尸剂8头和3×105悬浮液+虫尸剂8头施入后，在0～10 cm土层中的H.megidis0627M的种群数量分别为615.14、708.52、798.27、684.35和940.35头，均显著高于11～20 cm和21～30 cm土层中的种群数量.且在0～10 cm土层中，3×105悬浮液+虫尸8头的施用方法下昆虫病原线虫H.megidis0627M的种群数量为940.35，显著高于其他4种施用方法(表1).

图 昆虫病原线虫的田间消长规律Figure 1 Population dynamics of entomopathogenic nematodes in field

表1 昆虫病原线虫H.megidis 0627M和S.feltiae 0619H T越冬情况

2.2.2 昆虫病原线虫越冬时在土壤中的空间分布 研究结果表明，不同品系的昆虫病原线虫越冬分布情况存在差异，其中斯氏线虫S.feltiae0619HT主要分布在11～20 cm土层越冬，在11～20 cm土层中的分布占总数58%,显著大于0～10 cm和21～30 cm土层(P<0.05)，0～10 cm和21～30 cm土层分布之间差异不显著(P>0.05)；异小杆H.megidis0627M主要分布在0～10 cm土层越冬，在0～10 cm土层中的分布占总数56%,显著大于11～20 cm和21～30 cm土层(P<0.05)，11～20 cm和21～30 cm土层分布之间差异显著(P<0.05，图2).

2.3 旱区昆虫病原线虫的越夏观测

2.3.1 不同施用方法对越夏的影响 研究结果表明，在不同的施用方法下，S.feltiae0619HT和H.megidis0627M越夏种群数量有差异，但均可安全越夏.其中在6～8月，在3×105悬浮液+虫尸剂8头的施用方法下，S.feltiae0619HT越冬种群数量分别为593头、582头、585头，均显著高于其他施用方法(P<0.05).6～8月之间种群数量差异不显著(P>0.05)；在8月份时，3×105悬浮液+虫尸8头的施用方法下昆虫病原线虫H.megidis0627M越冬种群数量为432头，显著高于其他施用方法(P<0.05).6～8月之间种群数量差异不显著(P>0.05，表2).

图2 昆虫病原线虫越冬分布情况Figure 2 Distribution of entomopathogenic nematodes during over wintering period

表2 昆虫病原线虫H.megidis 0627M和S.feltiae 0619H T越夏情况

2.3.2 昆虫病原线虫越夏时在土壤中的空间分布 研究结果表明，S.feltiae0619HT与H.megidis0627M的越夏分布情况无明显差异，都集中在11～20 cm土层中.其中斯氏线虫S.feltiae0619HT主要在11～20 cm土壤层中进行越夏活动，在11～20 cm土层中的分布占总数57%,显著大于0～10 cm和21～30 cm土层(P<0.05)，0～10 cm和21～30 cm土层分布之间差异不显著(P>0.05)，异小杆H.megidis0627M主要分布在11～20 cm土层越冬，在11～20 cm土层中的分布占总数60%,显著大于0～10 cm和21～30 cm土层(P<0.05)，11～20 cm和21～30 cm土层分布之间差异不显著(P>0.05，图3).

3 讨论

李春杰等[26]研究发现，越冬过程中随温度的降低，异小杆线虫Heterorhabditisbacteriophora-HBN有向深层土壤迁移的趋势，但移动距离很小；Susurluk[27]认为在低温条件下，线虫会进行垂直向上的迁移运动，低温对异小杆H.bacteriophora线虫的迁移能力抑制性较强，而对斯氏线虫的抑制力弱.本试验调查结果与他们的研究结果相符合，2种昆虫病原线虫斯氏线虫S.feltiae0619HT和异小杆线虫H.megidis0627M在施用时处于同一深度，而在越冬调查时其种群空间分布情况有了较大的差异，斯氏线虫S.feltiae0619HT主要分布在11～20 cm土壤深度中，异小杆线虫H.megidis0627M则主要分布在0～10 cm土壤深度中，说明斯氏线虫的空间移动能力要比异小杆线虫强.

图3 昆虫病原线虫越夏分布情况Figure 3 Distribution of entomopathogenic nematodes during oversummering period

Kung等[28]研究表明土壤温度较高不利于昆虫病原线虫活动，甚至会导致线虫的死亡.本试验调查结果显示，越夏时2种昆虫病原线虫的种群数量降低，且随着温度的升高，2种昆虫病原线虫越夏时在0～10 cm的土层中的线虫数量最少，主要集中在21～30 cm，说明夏季高温对昆虫病原线虫的活动和种群数量造成了影响.因此在夏季施用昆虫病原线虫时，应考虑温度对昆虫病原线虫活动和种群数量的影响，尽量在低温天气施用，且应将线虫施入较深土层.

在大田环境下，仅施用昆虫病原线虫悬浮液能够保证在施用初期拥有一个较高的种群密度，提高防治效果，但短时间内其种群密度下降明显；单一施用虫尸剂在越冬后其种群数量会有明显上升，但在施用初期种群密度小，在寒冷环境下昆虫病原线虫释放较慢.而施用悬浮液+虫尸剂后，悬浮液可以使昆虫病原线虫在施用初期有一个较大的种群密度，虫尸剂在低温下又减缓了线虫的发育和释放并且帮助昆虫病原线虫躲避恶劣环境、安全越冬.因此，施用悬浮液+虫尸剂既确保了初始种群密度，又可以保证在越冬后仍保持一个较高的种群密度，是一种较为优秀的田间施用方法.

本试验研究了不同施用方式下2种昆虫病原线虫在兰州地区的越冬越夏及田间消长规律，为两种昆虫病原线虫在旱区应用提供了一定理论依据.但昆虫病原线虫在田间实际应用中还受到很多因素的影响，如紫外辐射、土壤质地类型、寄主昆虫的种类和数量、喷施杀虫剂和日常的农田管理等.因此，在实际运用时还需综合考虑其他因素.

4 结论

S.feltiae0619HT和H.megidis0627M施用后，均能在田间建立稳定种群，在田间推广应用的前景较为广阔.在3×105悬浮液+虫尸剂8头的施用方法下，S.feltiae0619HT比H.megidis0627M更易在田间建立种群和定殖生存；两种昆虫病原线虫在越夏期6～8月时种群数量和其他月份差异不显著，但其空间分布发生变化.

不同施用方法下，斯氏线虫S.feltiae0619HT和异小杆H.megidis0627M均可在甘肃兰州田间安全越冬.3×105悬浮液+虫尸剂8头施用方法下，2种昆虫病原线虫的越冬种群数量均显著高于其他施用方法；不同品系的线虫越冬分布情况存在差异，斯氏线虫S.feltiae0619HT主要在11～20 cm土壤深度越冬；异小杆线虫H.megidis0627M主要在0～10 cm土壤深度越冬，2种品系的昆虫病原线虫在21～30 cm土壤深度均分布较少.

不同施用方法下，斯氏线虫S.feltiae0619H和异小杆线虫H.megidis0627M均可在甘肃兰州田间安全越夏.其中3×105悬浮液+虫尸剂8头的施用方法下，2种昆虫病原线虫的越夏种群数量均显著高于其他施用方法；斯氏线虫S.feltiae0619HT和异小杆线虫H.megidis0627M越夏土壤深度都为11～20 cm.

悬浮液+虫尸剂的施用方法既能确保施用初期的昆虫病原线虫种群密度，有利于昆虫病原线虫建立稳定种群，同时可保证昆虫病原线虫在越冬越夏后有较高的种群密度，是一种较为优秀的田间施用方法.