扶正祛邪汤对肝癌模型大鼠肠道菌群微生态环境的作用研究

王 军，徐建良，杜燕红

(湖北省中医院，湖北 武汉 430000)

肝癌分为原发性、转移性两大类，患有肝癌的患者会出现消瘦、纳差、肝区疼痛、乏力、腹胀等症状[1]。转移性肝癌指的是原发于其他器官的恶性肿瘤侵犯到肝脏，一般比较常见的多在胆道、胃、卵巢、肺、结直肠等人体器官的恶性肿瘤转移至肝脏[2]。现有的治疗肝癌的方法有手术切除、消融、TACE、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗等综合性的治疗方法。肝癌的危害性极大，可以并发上消化道出血，肝癌破裂出血、肝衰竭等。肝癌的肿瘤分期、分型、预后都与基础疾病、肝癌累及范围都有着密不可分的关系，原发性肝癌与长期吸烟、酗酒、病毒性肝炎、寄生虫、饮水污染、遗传、毒物等多种因素有关。目前使用西医治疗虽然有很好的治疗效果，手术后可以看到明显的恢复，但是西医治疗不适当的应用可能会加重患者的肝脏损伤，同时肝癌具有较高的转移率以及复发率，会导致术后远期疗效不佳[3]。手术切除治疗原发性肝癌会有一定的局限性，手术切除率较低，对临床状况较差或合并肝外转移的中、晚期肝癌、弥漫型肝癌和术后肝内广泛复发仍无能为力。中医可以治疗疾病的根本，治疗时间虽然长，但是可以减少疾病的复发率，中医治疗还可以提高机体的自愈能力，帮助身体恢复。中医治疗主要是通过调节正气为主，因此预防小肝癌术后复发是中医的优势，同时中医治疗与西医治疗肝癌相比，中医治疗在抗复发或者抗转移上有着绝对的优势[4]。基于上述研究，在本文中观察扶正祛邪汤应用于肝癌模型大鼠的干预治疗，分析其对肝功能恢复的作用，为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料 研究动物：选取96只SPF级SD大鼠，购于河南天致药业有限公司[动物许可证号：syxk(豫)2020-0008]，在相对湿度30.15%～35.21%、温度为(31.04±2.40)℃的环境中喂养大鼠168 h，平均每天光照12 h。

主要试剂：兔抗大鼠TLR4抗体(南京赛泓瑞生物科技有限公司)，货号：SCA753Mu02；兔抗大鼠NF-κB抗体(上海雅吉生物科技有限公司)，货号：YS04244B。

扶正祛邪汤：甘草、乌梅各20 g，当归30 g，茵陈蒿、赤芍各18 g，威灵仙15 g，姜黄、柴胡、僵蚕各10 g，山慈菇9 g，郁金8 g，黄连5 g，白花蛇舌草7 g。

1.2 实验方法

1.2.1 建模、分组及给药:随机选取96只中32只大鼠作为正常组，其余64只大鼠参照贾鹂等[5]建立大鼠肝癌模型，腹腔注射0.2%二乙基亚硝胺大鼠(20 mg/kg)，7 d一共给药3次，连续进行28 d，结束后停药14 d，第49天开始给大鼠灌胃0.01% DEN，第98天后结束喂养，随机选取2只大鼠切除瘤组织进行病理组织学检查是否建模成功。将建模成功的64只肝癌模型大鼠随机分为模型组、给药组各32只。给药组大鼠采用350 mg/kg的扶正祛邪汤灌胃， 2次/d，连续灌胃29 d；模型组、正常组采用相同剂量的生理盐水对大鼠进行灌胃处理。在29 d后观察大鼠肝损伤情况。

1.2.2 病理组织学观察:从大鼠体内取出肝组织然后进行冲洗，接着在乙醇溶液中进行脱水处理，脱水完成后将肝组织放在二甲苯中透明处理后进行石蜡包埋，切60 μm的组织切片，将切片以61 ℃进行烘焙，烘焙完成后使用乙醇、二甲苯脱蜡进行脱水处理，然后对切片进行染色，染色时使用苏木素染液，染色时间为5 min，然后经过透明、封片、脱水处理后，将切片放在光镜下观察肝组织病理学的变化情况。

1.2.3 肠道菌群微生态环境检测:采用粪便检测法检测肠道菌群微生态环境，在大鼠接受治疗前24～48 h和治疗后72～120 h后分别留取大鼠粪便1～2 g做为样本，样本放在-80 ℃的冰箱内保存。取出0.26 g的粪便样品放在功率管中，然后加入含有十二烷基横酸钠溶液61 μl后上下均匀，且无沉淀，将功率管固定在涡旋仪适配器上，震荡10 min，进行室温10000 g离心处理30 s，重复至过滤完全部上清液后得出肠道菌群微生态环境。

1.2.4 AFP、CA19-9、ALT水平检测:抽取三组大鼠的空腹静脉血2 ml，离心半径5 cm，平均转速3000 r/32 s进行离心处理8 min，分离上层血清，在-60 ℃的环境下保存备用，采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中AFP、CA19-9、ALT水平，标记酶标板，制作标准品，然后取试剂盒，以2∶3的稀释液稀释样品；在反应孔中加入已稀释的标准品100 μl/孔，在35.28 ℃的恒温孵育箱中湿育2 h；用洗涤液将反应板洗3次，加入1∶100倍稀释后的抗体工作液100 μl/孔，放于35.28 ℃恒温孵育箱中湿育48.23 min；继续清洗反应板4次后，在反应孔内加入TMB溶液100 μl/孔，置于35.28 ℃恒温孵育箱中48.23 min后在反应孔内加入终止液100 μl/孔终止反应，在450 nm波长测定吸光度，颜色反应深浅与AFP、CA19-9、ALT水平成正比，经绘制标准曲线计算AFP、CA19-9、ALT水平。

1.2.5 TLR4/NF-κB信号通路检测:采用Western blot法检测三组大鼠体内TLR4/NF-κB信号通路TLR4、NF-κB的表达量，以GAPDH作为内参蛋白。将采集到的瘤组织以500 g进行离心处理8.5 min，提取上清液，BCA进行蛋白定量检测，在2×SDS凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，在85 ℃的环境中加热6 min，在4.27 ℃的环境下，在6%的脱脂牛奶中固定进行封闭处理，时间为63 min，将一抗使用0.05%～0.1%封闭液给予TLR4、NF-κB 1∶500进行稀释，在5 ℃的孵育进行过夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗2次膜，每次洗膜时间为7 min，二抗被0.05%～0.1% TBST 1∶500进行稀释，摇动孵育时间为63 min，再次采用TBST连续洗2次膜，处理时间为7 min。DAB显色，定量分析蛋白表达情况，内参蛋白设置为GAPDH。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，用F值进行多组间比较检验，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组大鼠病理组织学观察 正常组大鼠肝脏健全，肝功能无受损现象；模型组大鼠肝脏严重受损，且有癌细胞；给药组大鼠肝脏受损伤程度逐渐减轻，肝组织炎症性细胞减少，肝脏结构较完整(图1)。

图1 三组大鼠肝组织病理变化观察(HE染色，×400)

2.2 三组大鼠肠道菌群微生态环境比较 见表1。模型组、给药组大鼠肠道菌群微生态环境高于正常对照组，差异具有统计学意义(均P<0.05)；给药组大鼠肠道菌群微生态环境低于模型组，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 三组大鼠肠道菌群微生态环境比较(MPN/g)

2.3 三组大鼠AFP、CA19-9、ALT表达水平比较 见表2。模型组、给药组大鼠AFP、CA19-9、ALT高于正常对照组，差异具有统计学意义(均P<0.05)；给药组大鼠AFP、CA19-9、ALT低于模型组，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表2 三组大鼠CA19-9、AFP、ALT表达水平比较

2.4 三组大鼠TLR4/NF-κB信号通路因子比较 见表3。模型组、给药组大鼠TLR4/NF-κB水平高于正常对照组，差异具有统计学意义(均P<0.05)；给药组大鼠TLR4/NF-κB水平低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 三组大鼠TLR4/NF-κB信号通路因子比较(%)

图2 TLR4/NF-κB信号通路因子免疫蛋白印迹图

3 讨 论

肝癌是在世界上发病率和病死率较高的肿瘤，一般男性的发病率要大于女性，这与男性的日常生活习惯、长期抽烟、酗酒、作息不规律有着极大的关系[6]。在前期时会感觉乏力、食欲不振等，到后期会出现面色暗黄、腹水、呕血、昏厥的症状[7]。肝癌是一种恶性肿瘤，平时患病最多的肝癌指的多是原发性肝癌，除了原发性肝癌外还有一种指的是继发性肝癌[8]。继发性肝癌指的是因除了肝脏外其他器官所导致的恶性肿瘤，一般侵犯的途径是通过血液淋巴系统转移到肝脏的[9]。原发性肝癌主要发生的原因就是因慢性肝癌病毒感染有关的，除此之外也与一些致癌药物、食物、饮酒、吸烟有关，长期的脂肪肝和有家族病史的也会因此患有肝癌的风险。日常一定要注意健康的饮食，也要定期去体检，早发现，早治疗。一般肝癌患者的体内瘤块较小治疗的效果就会越好，甚至还有些患者可以自愈，不过恶性肿瘤也有转移和复发的情况，在接受手术治疗后也要定期复查，现有的治疗肝癌的方法有：手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、生物治疗和中药治疗，早期的肝癌患者在接受了治疗后，在术后存活的几率还是比较大的[10]。目前临床中还是缺乏有效的治疗肝癌的手段，为了早日研究出针对性治疗的药物具有重要的意义。

扶正祛邪汤可以起到一定的延缓肿瘤发展的作用，还可以稳定瘤体，调节并稳定肝功能的作用，可以有效的改善并提高患者生活质量、临床症状[11]。扶正祛邪汤取自《本草纲目》，扶正祛邪汤中含有甘草、威灵仙、赤芍、姜黄、郁金、柴胡、黄连、山慈菇、白花蛇舌草、茵陈蒿、乌梅、僵蚕、当归[12]。其中黄连、山慈菇、白花蛇舌草、茵陈蒿可以利湿退黄，清热解毒。甘草有清热解毒、补脾益气、缓急止痛的功效，可以抗肿瘤、保护肝脏、抗病毒、增强免疫力[13]。威灵仙有着抗肿瘤、镇痛、利胆和促进造血的作用[14]。山慈菇可以化瘀散结、清热解毒、抗菌、抗肿瘤。郁金可以利胆退黄，行气解郁、保护肝脏、抗炎、抗肿瘤[15]。此结论提示着，使用扶正祛邪汤可改善患者机体炎症反应，有效的治疗肝癌所导致的肝功能受损。

肠道菌群微生态环境，指的是肠道微生态，微生态系统包括皮肤、泌尿、胃肠道、口腔四个，其中肠道微生态系统是最复杂的，是由肠道正常菌群及所生活的环境共同构成的，肠道正常菌群也是微生态系统中最核心的部分，占人体总微生物量的78%[16]。微生态可以稳定肠道内环境，维持人体功能，还可以起到保护作用、营养作用、参与机体物质代谢、促进营养物质消化吸收、菌群屏障作用、防癌抑癌作用[17]。研究结果发现，经扶正祛邪汤干预后，肝癌大鼠肠道菌群微生态环境显著改善，此结果提示着，扶正祛邪汤可改变肝损伤，抑制疾病进展。

甲胎蛋白又称甲种胎儿球蛋白，可以用作肝癌的检测与诊断，甲胎蛋白水平的高低可以检测是否患有肝癌，可以作为早期肝癌的诊断，甲胎蛋白是一种糖蛋白，属于蛋白家族，具有很多重要的生理功能，包括免疫抑制、双向调节等[18]。与多种肿瘤以及肝癌的发展有着密切相关的关系，可以作为肿瘤阳性检测的指标，是一种原发性肝癌的标志物。肿瘤标志物(CA19-9)是一种肿瘤细胞的代谢产物、分化紊乱的细胞基因产物、肿瘤细胞坏死崩解释放进入血液循环的物质、肿瘤宿主细胞的细胞反应性产物[19]。可以用作肿瘤早期发现、肿瘤患者化疗、手术、放疗疗效的检测、肿瘤的诊断、肿瘤的分期、复发、预后以及寻找不知来源的转移肿瘤的原发灶。谷丙转氨酶(ALT)主要存在人体的心脏、肝脏组织的细胞中，是一种敏感的标志。研究结果发现，经扶正祛邪汤干预后，肝癌大鼠CA19-9、AFP、ALT水平改变显著改善，此结果提示着，扶正祛邪汤可改变CA19-9、AFP、ALT水平，有效的治疗肝癌。

TLR4/NF-κB信号通路，TLR4与肝癌的发展有着密切的关系，在感染肝癌的大鼠体内TLR4的水平属于异常表达，TLR4可以作为肝癌肿瘤的研究方向，肝癌大鼠的血清可以通过激活TLR4信号通路来诱导分泌[20]。TLR4信号通路是涉及免疫调节和炎症反应的，以TLR4作为靶点，激活树突状细胞以及杀伤性T细胞也可以有效的抑制癌细胞的生长。TLR4可以作为跨膜蛋白，识别细菌和真菌的细胞壁成分，发挥天然免疫识别作用，通过TLR4的介导胞内信号转导途径，激活天然免疫的细胞，从而导致免疫炎症的反应。刺激TLR4信号通路导致肝癌炎症状态，由此说明TLR4是被认为参与肝癌序列的参与者的[21-22]。NF-κB不正确的调节与癌、自身免疫疾病、炎症、感染性休克、免疫发育、病毒感染都有关，NF-κB家族中有五位成员，核因子是细胞内重要的核转录因子，可以参与肝癌的炎症反应与免疫应答，还可以调节肝癌的应激反应调节细胞的凋亡，可以通过药物来抑制核因子-κB信号转导通路，会成为一种重要的治疗手段，NF-κB调节的靶蛋白包括：促血管生长因子、促转移因子、黏附因子、生长因子、细胞周期控制因子、促凋亡因子[23-25]。以上论述说明，肝癌可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，抑制肝癌导致的肝功能损伤。

虽然本文认为扶正祛邪汤作用于TLR4/NF-κB信号通路发挥其作用，但本试验样本量较少，在数据统计时可能存在一定的偏倚，且目前并未有研究发现扶正祛邪汤与TLR4/NF-κB信号通路之间的关系，因此本文研究结果还需后续试验进一步研究证实。

综上所述，扶正祛邪汤作用于TLR4/NF-κB信号通路，调控通路因子以及肠道菌群微生态环境，改善肝癌引起的肝损伤，进而恢复肝功能。