不同微生物发酵剂对核桃青皮的发酵效果研究

吴柳燕，付莉，付品，朱佳敏，赵玉雪，杨霞

（贵州省核桃研究所，贵州贵阳 550002）

我国核桃栽培面积居世界首位，核桃青皮含有生物碱、鞣质、多酚类、黄酮类、单宁类、香豆素、萜类、甾类和有机酸物质等多种有机化合物，因此具有一定的植物源农药活性。堆置在野外的核桃青皮经雨水漫泡后，浸出液流入江、河、湖泊中，河水变黑，鱼、虾全被毒死，对水体造成严重污染；而且核桃青皮中的纤维木质素含量高，碱性较强，在自然界中降解速度慢，不易腐烂，堆置在田间则导致庄稼（甚至杂草）难以生长。研究发现，核桃青皮质地松软，有机质含量高，干青皮含纤维素约17%，木质素约43%，还含有较高的K、Ca以及Fe、Mn、Zn、Mg、Cu等微量元素。

梁林波等[1]研究发现，在核桃青皮堆肥过程中加入微生物发酵菌剂能使堆肥温度升高，大大缩短堆肥时间，加快核桃青皮的堆肥腐熟。鉴于此，笔者研究微生物发酵剂对核桃青皮的发酵效果，以期挑选出对核桃青皮降解效果最好的微生物发酵剂，不仅能有效缓解核桃青皮还田带来的环境污染，还能为核桃青皮制成生物有机肥奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

①微生物发酵剂：郑州启富农业科技有限公司；②有机物料发酵剂：君德生物科技有限公司；③沃宝：河南沃宝生物科技有限公司；④青皮腐解物：拨开堆积的青皮腐解物，5点法取内部样品，置于无菌袋中，4℃保存备用；⑤森林土壤：除去5 cm表层土壤，取5～10 cm土壤样品，置于无菌袋中，去掉草根、石子后过1 mm筛，4℃保存备用；⑥CK：对照不加任何发酵剂。

1.2 培养基

1.2.1滤纸条崩解培养基。(NH4)2SO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、酵母粉0.1 g、滤纸条1 cm×6 cm 3条/瓶，pH 7.0，蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌20 min。

1.2.2核桃青皮降解率测定培养基。干燥的青皮粉末5 g、（NH4）2SO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.02 g，5 mmol/L pH=7的磷酸缓冲液15 mL，蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌20 min。

1.3 滤纸条崩解试验

称取0.5 g不同的发酵样品，加入50 mL滤纸条崩解培养基中，50℃静止培养，记录pH变化情况。滤纸刚分解断裂时，转接于同样新鲜培养液中，如此分别转接数代后，记录崩解情况。

1.4 纤维素酶活性测定

分别取各发酵剂培养7 d的滤纸条（滤纸是聚合度中等的纤维素材料[2]，其活力代表了总纤维素酶活力）培养基上清液1 mL，按照以下步骤进行纤维素酶活性测定。

1.4.1标准曲线绘制。无水葡萄糖80℃烘至恒重，制成1 mg/mL标准液，取6支试管分别加入标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，补加蒸馏水至2 mL，加入DNS试剂1.5 mL，沸水浴5 min，冷却后定容至25 mL，分光光度计540 nm下测OD值。

1.4.2粗酶液制备。配制复筛培养基每瓶45 mL，接入5 mL种子悬液，置于28℃摇床中培养，3、7、11 d分别取1.5 mL于离心管中，10 000 r/min离心10 min得粗酶液。

1.4.3酶活性测定。取1 mL培养基上清液，10 000 r/min离心10 min得粗酶液。加入1 mL质量分数1%CMC-Na溶液，在45℃下恒温水解20 min，加入1.5 mL DNS显色，沸水浴5 min，冷却后定容至25 mL，分光光度计540 nm下测OD值（m1）。另外做对照，取上清1 mL，加入1 mL蒸馏水，在45℃下恒温水解20 min，加入1.5 mL DNS显色，沸水浴5 min，冷却后定容至25 mL，分光光度计540 nm下测OD值（m2）。m1-m2=A，酶活力(μmol/mL)=A×1 000/2[3]。

1.5 不同发酵剂对核桃青皮的降解效果研究

使用三角瓶固体发酵的方法研究不同发酵剂对核桃青皮的降解效果。配好的核桃青皮降解率测定培养基分装在6个250 mL三角瓶里，每瓶加入发酵剂0.1 g，以不加发酵剂为对照，混匀后置于50℃恒温箱培养，10 d后测定其降解率。用无菌蒸馏水洗去可溶部分，过滤，将剩余物置于105℃烘箱中烘至恒重，用分析天平分别称重记为M（g），降解率=（M-5）/5×100%。

2 结果与分析

2.1 滤纸条崩解试验pH变化及接代数情况

由表1可以看出，1号和3号的pH一直增大，而2号的pH先减小后增大，4号（青皮腐解物）和5号（森林土壤）的pH先增大后减小。

表1 滤纸条崩解试验pH变化情况

由表2可以看出，2号发酵剂对滤纸条崩解见效快，但是持续繁殖能力较弱，而1号发酵剂能够转接15代，持续98 d对滤纸条具有分解效果，说明1号发酵剂对纤维素的降解效果较好。

表2 滤纸条崩解试验转接代数情况

2.2 标准曲线测定

采用DNS还原法测定还原糖量[4]，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，作葡萄糖标准曲线（图1）。

图1 葡萄糖标准曲线

通过拟合得葡萄糖标准曲线为：y=0.521x+0.004 3（R2=0.994 3），其中y表示吸光度（A），x表示葡萄糖浓度（mg/mL）。

2.3 不同降解剂作用下的纤维素酶活性

由表3可知，1号发酵剂的酶活性较高，在11 d时达到67.0 U/mL，说明其降解纤维素效果最好，而2号和3号发酵剂次之，4号和5号样品对纤维素的降解效果较差。

表3 不同降解剂作用下的纤维素酶活性 U/mL

2.4 不同发酵剂对核桃青皮的降解率

由表4可知，1号发酵剂对核桃青皮的降解效果较好，在10 d时可以达到25.5%，而2号和3号降解效果次之，这与其对纤维素的降解效果一致。

表4 不同发酵剂对核桃青皮的降解效果

3 结论与讨论

根据滤纸条崩解试验、纤维素酶活测定以及核桃青皮降解效果研究可知，1号微生物发酵剂（由地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌等组成）对核桃青皮的降解效果最好，可以作为核桃青皮降解处理的首选制剂。核桃青皮作为农业废弃物，如果随意堆放，既污染环境，又造成浪费，用发酵剂合理发酵后作为肥料回田，可以减少污染，使资源得以循环利用。该研究为核桃青皮的开发利用提供了一定依据。