桑树青枯病与根际土壤肥力及微生物群落结构特征的研究

覃仁柳，林刚云，吴银秀，黄小丹，杨尚东，屈达才

（广西大学农学院，南宁 530004）

桑树Morus albaL.在种植过程中，易受气候、土壤和桑园周边生态环境影响，常导致多种病虫害发生。由青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的青枯病是桑树最主要的细菌病害之一，具有爆发快、损失重、防治难的特点[1]。青枯病原菌在土壤中定殖，主要通过植株根部或茎部的伤口或次生根冠侵入，病菌首先在皮层的细胞间隙中生长繁殖，随后入侵到木质部维管束中，大量繁殖并迅速蔓延至整个植株，阻断水分运输，导致叶片凋零，最终造成桑树的死亡。近年来，青枯病在我国重点蚕区——广西危害愈发严重，造成桑叶产量大幅下降，桑园面积骤减，对蚕桑产业的稳定和可持续发展造成威胁[2]。

研究表明，青枯病的发生、加剧均与土壤微生态失衡有密切的关系。土壤微生物具有维持植物健康、促进植物生长和降解毒害物质等重要功能[3]。根际土壤细菌在保护植物免受病原微生物的侵染过程中扮演着重要角色。例如，番茄抗青枯病植株根际土壤中高丰度的黄杆菌科Flavobacteriaceae 微生物可以帮助易感病番茄抵御青枯菌的侵害[4]。根际土壤真菌在生物防治、有害物质吸附和降解等方面同样发挥着重要作用。例如，木霉属真菌在黄瓜枯萎病菌、香蕉枯萎病菌、大豆根腐病菌、立枯丝核菌和终极腐霉菌都有拮抗作用[5]。

为此，本文基于高通量测序技术，比较分析桑树青枯病发病与健康植株根际土壤细菌和真菌群落结构的变化，评价与解析桑树青枯病发病与健康植株根际土壤肥力状况及微生物群落结构特征的差异，为构建桑树青枯病生物防治技术体系提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与样品采集

试验地位于广西壮族自治区南宁市广西大学农学院蚕桑教学实习基地桑园（东经 108°17′14″，北纬22°51′17″）。试验地气候属亚热带季风气候，阳光充足，雨量充沛，年平均气温 21.7 ℃，年均降雨量达1600 mm。桑园土壤类型为赤红壤，土壤pH 5.79，有机质含量6.75 g/kg，全氮0.84 g/kg，全磷0.53 g/kg，全钾14.54 g/kg，碱解氮57.45 mg/kg，速效磷3.39 mg/kg，速效钾81.77 mg/kg。常规田间管理。

2020年6月18日于广西大学农学院教学实习基地桑园进行，随机采集青枯病发病和健康桑树（桑树品种名：台湾长果桑，6年树龄）植株根际土壤样品。土壤样品采集前，首先使用75%乙醇消毒液对铁铲进行消毒，然后分别随机采集桑树青枯病发病植株和健康植株根际土壤。具体采样操作：以桑树为中心挖取青枯病发病和健康植株根系，采用抖根法[6]收集植株根际土壤样品，并装入无菌密封袋，放入预先放置冰袋的冰盒中带回实验室。每份土壤样品分为2部分，一部分在室内自然风干后过40目筛，用于土壤理化性质测定；另一部分过10目筛，置于-80 ℃冰箱，用于土壤生物学性状与微生物群落结构分析。

1.2 土壤生物学性状分析

土壤中 C、N、P 循环相关酶β-葡糖苷酶（β-glucosidase）活性测定采用 Hayano[7]的方法，氨肽酶（Aminopeptidases）活性测定采用Ladd[8]的方法，磷酸酶（Phosphatase）活性测定采用Tabataba[9]的方法。土壤微生物生物量碳、氮、磷测定均采用氯仿熏蒸浸提法。其中微生物生物量碳测定采用容量分析法[10]、微生物生物量氮测定采用茚三酮比色法[11]、微生物生物量磷测定采用磷钼蓝比色法[12]测定。

1.3 土壤微生物群落分析

总DNA的提取根据E. Z. N. A. Soil DNA 试剂盒（美国Omega公司）说明书进行，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000分光光度计（美国Thermo公司）进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。以提取的土壤微生物DNA为模板，选用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16S rRNA V3-V4区进行PCR扩增，选用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和 ITS2F（5'-GCTGCGTTCTTCATCATCGATFC-3'）对真菌18S rRNA ITS区进行PCR扩增，PCR仪采用ABI GeneAmp® 9700型。用2%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，使用 Axy PrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）纯化，Tris_HCl洗脱，将 PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程，将纯化后的扩增片段构建文库。利用Illumina公司的MiSeq PE300和MiSeq PE250平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

1.4 数据统计与分析

采用 Excel 2010软件和SPSS 19.0统计软件对试验数据进行统计分析，数据以“平均值±标准差（SD）”表示，高通量检测数据通过Usearch（vsesion 7.0）软件以及I-sanger平台进行分析处理。本研究数据中，Simpson和Shannon指数用于估算样本中微生物多样性；Ace和Chao1指数用于表示物种丰富度；Heip指数用于表示土壤微生物群落均匀度；Coverage用来表示样本覆盖度。Chao1、Shannon、Heip 指数越大，Simpson 指数越小，说明样品的物种丰富度、多样性和均匀度越高[13]。

2 结果与分析

2.1 桑树青枯病发病植株与健康植株根际土壤肥力

由表1可知，桑树青枯病发病植株根际土壤中，β-葡糖苷酶和磷酸酶活性均显著低于健康植株，而氨肽酶活性显著高于健康植株。另一方面，发病植株根际土壤中微生物生物量碳和磷均显著低于健康植株，微生物生物量氮在两种处理间无显著差异。

表1 发病和健康植株根际土壤酶活性及微生物生物量Table 1 Soil enzyme activities and microbial biomass in rhizosphere soil between infected and non-infected plants

2.2 桑树青枯病发病植株与健康植株根际土壤细菌群落结构

2.2.1 根际土壤细菌多样性 由表2可知，桑树青枯病发病植株与健康植株根际土壤细菌的Coverage指数均在97%以上，表明测序结果可代表样本中细菌的真实情况。桑树青枯病发病植株根际土壤细菌的Shannon指数和Heip指数均显著高于健康植株，Simpson指数显著低于健康植株；Ace指数和Chao1指数在两种处理间无明显差异。

表2 发病和健康植株根际土壤细菌多样性指数Table 2 Diversity index of bacteria in rhizosphere soil between between infected and non-infected plants

2.2.2 根际土壤细菌门分类水平 桑树青枯病发病植株与健康植株根际土壤中，占比大于1%的优势细菌门分别为14个和13个（表3）。其中，发病植株根际土壤中优势细菌类群为变形菌门Proteobacteria、放线菌门 Actinobacteriota、酸杆菌门 Acidobacteriota和绿弯菌门 Chloroflexi，它们的相对丰度分别为22.96%、16.74%、15.96%和14.20%，健康植株根际土壤中它们的相对丰度分别为20.53%、20.45%、21.88%和 13.27%。其次为厚壁菌门 Firmicutes、粘球菌门 Myxococcota、拟杆菌门 Bacteroidota、芽单胞菌门Gemmatimonadota、脱硫酸杆菌门Desulfobacterota、Methylomirabilota、浮霉菌门Planctomycetota、硝化螺旋菌门Nitrospirota、匿杆菌门Latescibacterota、疣微菌门Verrucomicrobiota，发病植株根际土壤中它们的相对丰度分别为4.47%、4.42%、3.65%、2.55%、2.17%、2.08%、1.75%、1.53%、1.35%和1.02%，健康植株根际土壤中它们的相对丰度分别为3.17%、3.49%、2.19、2.38%、1.25%、1.86%、2.34%、0.90%、1.45%和1.79%。

表3 根际土壤细菌门分类水平的组成与相对丰度Table 3 Relative abundance of bacteria phylum in rhizosphere soil

与健康植株相比，桑树青枯病发病植株根际土壤优势细菌门分类水平组成发生变化。其中，硝化螺旋菌门Nitrospirot细菌富集，变形菌门Proteobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、粘球菌门Myxococcota、厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidota、芽单胞菌门Gemmatimonadota、脱硫酸杆菌门Desulfobacterota、Methylomirabilota的相对丰度分别增加了2.43%、0.93%、0.93%、1.30%、1.46%、0.17%、0.92%、0.22%，酸杆菌门Acidobacteriota、放线菌门Actinobacteriota、浮霉菌门Planctomycetota、匿杆菌门Latescibacterota1和疣微菌门Verrucomicrobiota的相对丰度分别降低了5.92%、3.71%、0.59%、0.10%和0.77%。

2.2.3 根际土壤细菌属分类水平 桑树青枯病发病植株与健康植株根际土壤中，相对丰度大于 1%的优势细菌属分别为11个和10个（表4），相对丰度前4位的优势细菌属及其占比分别为Vicinamibacterales（5.33%和 8.58%）、Vicinamibacteraceae（4.79%和 7.50%）、Gaiella（2.18%和 2.72%）和芽单胞菌科属Gemmatimonadaceae（2.17%和1.99%）。与健康植株相比，桑树青枯病发病植株根际土壤中，芽单胞菌科属Gemmatimonadaceae、Methyloligellaceae和Rokubacteriales优势菌属相对丰度分别增加了0.18%、0.42%和0.13%；Vicinamibacterales、Vicinamibacteraceae、Gaiella、黄色杆菌属Xanthobacteraceae、盖勒氏菌属Gaiellales和Latescibacterota优势菌属相对丰度分别下降了3.25%、2.71%、0.54%、0.47%、0.46%和0.22%。此外，桑树青枯病发病植株根际土壤中富集了硝化螺菌属Nitrospira和放线菌属Actinomarinales特有优势细菌属；健康植株根际土壤中富集了链霉菌属Streptomyces特有优势细菌属。

表4 根际土壤细菌属分类水平的组成与相对丰度Table 4 Relative abundance of bacteria genus in rhizosphere soil

2.3 桑树青枯病发病植株与健康植株根际土壤真菌群落结构

2.3.1 根际土壤真菌多样性 由表5可知，桑树青枯病发病植株与健康植株根际土壤真菌的Coverage均在99%以上，表明测序结果可代表样本中真菌的真实情况。桑树青枯病发病植株根际土壤中的Ace和Chao1指数显著低于健康植株，发病植株根际土壤的Shannon指数和Heip指数也低于健康植株，但两种处理间的Shannon指数和Heip指数无显著差异。结果表明，桑树青枯病发病植株根际土壤真菌丰富度低于健康植株，真菌的多样性和均匀度在发病和健康植株间无明显差异。

表5 发病与健康植株根际土壤真菌多样性指数Table 5 Diversity index of fungi in rhizosphere soil between infected and non-infected plants

2.3.2 根际土壤真菌门分类水平 桑树青枯病发病植株和健康植株根际土壤中相对丰度大于 1%的优势真菌门有4个（表6），分别为子囊菌门Ascomycota、unclassified_k__Fungi、担子菌门Basidiomycota和霉菌门Mortierellomycota。其中，发病植株根际土壤中它们的相对丰度分别为89.43%、2.62%、6.45%和0.86%，健康植株根际土壤中它们的相对丰度分别为80.81%、10.02%、5.29%和2.18%。由此可知，桑树植株出现青枯病危害症状时，根际土壤真菌优势菌门组成占比发生变化，子囊菌门Ascomycota和担子菌门Basidiomycota占比增加，unclassified_k__Fungi和霉菌门Mortierellomycota占比减少。

表6 根际土壤真菌门分类水平的组成与相对丰度Table 6 Relative abundance of fungi phylum in rhizosphere soil

2.3.3 根际土壤真菌属分类水平 桑树青枯病发病植株和健康植株根际土壤中，相对丰度大于 1%的优势真菌属分别为10个和15个（表7），共有的优势真菌属及其占比分别为杯盘菌属Ciboria（47.12%和27.55%）、微囊菌属Microascaceae（3.08%和14.08%）、丛赤壳属Nectriaceae（11.93%和2.63%）、unclassified_k__Fungi（2.62%和 10.02%）、新赤壳属Neocosmospora（3.43%和7.75%）、Apiotrichum（5.48%和 2.92%）、粪壳菌Sordariomycetes（4.93%和2.16%）。与健康植株相比，发病植株根际土壤中，杯盘菌属Ciboria、丛赤壳属Nectriaceae、Apiotrichum和粪壳菌Sordariomycetes的相对丰度分别增加了19.66%、9.30%、2.56%和2.23%，微囊菌属Microascaceae、unclassified_k__Fungi和新赤壳属Neocosmospora的相对丰度分别降低了11.00%、7.40%和4.32%。此外，发病植株根际土壤中富集了地霉菌属Geotrichum、腐质霉属Humicola和丝孢菌属Scedosporium特有优势真菌属；健康植株根际土壤中富集了被孢霉属Mortierella、镰刀菌属Fusarium、枝顶孢属Acremonium、子囊菌属Ascomycota、曲霉属Aspergillus、罗索菌属Roussoella、毛壳菌属Chaetomium和微囊菌属Microascus特有优势真菌属。

表7 根际土壤真菌属分类水平的组成与相对丰度Table 7 Relative abundance of fungi genus in rhizosphere soil

3 讨论

青枯病是一种土传性的细菌病害，土壤状态与发病的关系密切，发病程度受土壤质地、肥力[14]、温度[15]和湿度[16]等诸多因素的影响。由于青枯菌致病机制复杂、致病因子多样，需多种手段并用来防治。微生物是土壤生态系统最重要的组成部分，利用微生物及其代谢产物抵御作物病害是一种安全、可持续的防治方法[17]。至今的研究表明，土壤微生物可以通过竞争作用[18]、拮抗作用[19]、诱导抗性[20]和促进植物生长[21]等方面防治青枯病。因此，保持微生态平衡是控制青枯病的重要基础，采取农业措施与生物防治相结合的措施，改善土壤环境，构建土壤生物学状态、根际微生物与桑树生长的平衡体系，将有益于在桑树青枯病的防治中实现新的突破。

土壤酶是土壤生物化学的一个重要部分，土壤酶参与土壤中有机物质和营养元素的循环，其活性大小不仅能指示土壤生态系统功能变化的多样性和稳定性，亦是评价土壤健康和肥力水平的重要指标[22-24]。本研究发现，与健康植株相比，桑树青枯病发病植株根际土壤中，β-葡糖苷酶和磷酸二脂酶的活性显著降低，表明发病植株根际土壤养分循环效率降低，肥力下降；另一方面，土壤微生物生物量与有机质含量呈正相关，是衡量土壤质量的重要指标[25]。本研究亦发现，桑树青枯病发病植株根际土壤中，微生物生物量碳、磷均显著低于健康植株，表明发病植株根际土壤有机质含量较低，供给植物可吸收利用的微生物生物量减少。综上所述，桑树根际土壤微环境土壤肥力下降、有机质含量降低和养分供给不足可能是桑树植株出现青枯病病害症状的原因之一。

青枯菌作为一种细菌性病原菌，在侵染植株的过程中，会使植株根际的主要微生物丰度发生变化[26]。本研究中，桑树青枯病发病植株根际土壤细菌多样性Shannon指数和均匀度Heip指数高于健康植株，与根际土壤细菌多样性变化不同，桑树青枯病发病植株根际土壤中指示真菌丰富度的Ace指数和Chao1指数显著低于健康植株；尽管桑树青枯病发病植株根际土壤的多样性Shannon指数和均匀度Heip指数低于健康植株，但两种处理间没有显著差异。这一结果表明青枯病没有显著影响桑树根际土壤真菌的多样性和均匀度，但显著降低了发病植株根际土壤真菌的丰富度。造成这种结果的原因可能是青枯菌的侵染导致植株各部位的正常组织受到破坏，一些有益微生物流失，而真菌的定殖比细菌定殖更难，使得发病植株根际土壤真菌的丰富度降低。

细菌群落结构在发病与健康土壤间的差异可能是影响青枯病发生的关键因素[27]。本研究中，细菌门分类水平上，变形菌门、酸杆菌门和放线菌门是桑树发病和健康植株根际土壤细菌相对丰度前三位的的共有优势菌门，发病植株的变形菌门相对丰度高于健康植株，而酸杆菌门和放线菌门相对丰度低于健康植株。研究表明，变形菌门是细菌中最大的一门，包括很多的病原菌[28]；Mendes等[29]的研究认为放线菌门的相对丰度与抗病能力呈正相关，对植物病害具有防御作用；酸杆菌门可降解植物病残体多聚物，参与铁循环，进行光合作用，在土壤物质循环中具有重要的作用[30]。因此，桑树根际土壤中致病细菌的增加以及功能细菌的减少都与青枯病的发生密切相关。植物健康不仅由共有优势菌属数量和有益微生物数量决定，一些特异优势菌属也参与作用[31]。本研究中，细菌属分类水平上，桑树青枯病发病植株根际土壤中，富集了硝化螺菌属和放线菌属特有优势细菌属，但缺失了链霉菌属等特有优势细菌属。其中，桑树青枯病发病植株根际土壤中，缺失的链霉菌属具有产生抗生素的作用。抗生素主要来源于微生物次级代谢产物，而60%的抗生素由链霉菌产生[32,33]。如：链脲曲霉素[34]、沙霉素[35]、庆大霉素[36]、四环素类抗生素等均由链霉菌属的次级代谢产物分离而来，具有广谱的抗菌活性。由此推测，产抗生素的优势菌属链霉菌属的缺失和桑树抗性降低及感病有一定关联。

真菌作为生态系统中的主要分解者，在促进生态系统物质循环等方面具有重要作用，与细菌相比，真菌对于土壤环境的变化更为敏感[37]。本研究中，真菌门分类水平上，桑树青枯病发病植株根际土壤中的子囊菌门和担子菌门相对丰度明显高于健康植株。至今的研究表明，子囊菌门含有大量病原菌并聚集于植物根部，破坏作物根系表层，为其他致病菌的侵染创造条件[38]。担子菌门相对丰度高的土壤会诱导植株发生根腐病[39]。本研究中，真菌属分类水平上，发病植株根际土壤中，富集了地霉菌属、腐质霉属和丝孢菌属，而这些真菌属在健康植株根际土壤中的相对丰度小于1%。已有研究表明，地霉菌属真菌含有典型致病菌，广泛分布在烂菜、动物粪便和土壤等处；腐质霉属真菌是一种常见的土壤习居菌，腐生性较强，在土壤内或病株残体上长期存活[40]。同时，本研究中，桑树青枯病发病植株根际土壤缺失了被孢霉属、枝顶孢属、曲霉属和微囊菌属等优势真菌。已有研究发现，被孢霉属真菌体内含有大量多糖物质和蛋白，主导着纤维素、半纤维素和果胶物质的分解，影响植物营养生长[40]；枝顶孢属真菌的次生代谢产物中，富含酚类、萜类、环肽、蒽醌类等化合物，具有抑菌、抗疟等作用[41]；曲霉属真菌的次生代谢物同样具有抗菌、抗病毒的作用[42]；微囊菌属侵入植株根系后，与植株形成一个共生系统，起到传递营养的作用[43]。由此推测，桑树青枯病发病植株根际土壤中含有多种致病真菌，导致桑树的抵御能力降低，吸引更多腐生、病原真菌侵入植株。同时，多种具有产抑菌化合物真菌的丰度占比减少，根际微环境抑菌效果减弱，导致桑树植株更容易产生病害。

本研究揭示了桑树青枯病发病和健康植株根际土壤肥力以及细菌和真菌的群落结构特征。研究发现，桑树青枯病发病植株根际土壤肥力下降，发病植株根际土壤中潜在致病微生物（细菌和真菌）占比增加，而潜在抑病微生物占比下降，这可能是桑树发病植株呈现青枯病病害症状的重要原因。此外，从桑树健康植株根际土壤中，分离和筛选特异功能性微生物，为桑树青枯病生物防治提供支持。