梯度多孔载Ag羟基磷灰石陶瓷的制备和性能研究

陈 晨，于景媛，李 强

(辽宁工业大学材料科学与工程学院,锦州 121001)

0 引 言

羟基磷灰石(HA)具有较好的生物活性、生物亲和性和骨传导能力，是一种良好的硬组织替代材料，被广泛应用于临床医学研究中[1]。HA陶瓷可被制成骨形成支架或修复牙齿的人工种植体等医用制品[2]。目前，对致密HA材料的研究取得了较大进展。吴金结等[3]在体外建立微振动应力环境来模拟人体生理环境并研究了HA陶瓷在此应力环境下对力学性能、生物活性和骨诱导性能的影响。张永霞等[4]制备了 PPC/HA 复合材料，研究显示随着HA含量的增加PPC材料从韧性断裂变成了脆性断裂，由疏水材料变为亲水材料。Zhou等[5]将使用纳米HA制成的SB-1TM人工合成骨用于治疗骨组织受伤的兔子，并通过X射线技术来监控骨组织修复的过程，证明植入骨能够与兔子体内原有的骨组织进行结合，诱导新骨组织的生长。但是当HA陶瓷作为植入材料植入人体后，新生骨组织不能在植入体内部形成，而是仅局限在表面区域，这对HA与生物骨组织的进一步结合造成很大的困难，所以研究者制备出多孔HA生物陶瓷来解决这一问题[6-7]。多孔HA生物陶瓷具有多孔性质，多孔结构不但增加骨组织的接触面积而且为骨组织细胞在多孔HA的内部生长提供了便利的通道[8-10]。但是多孔HA陶瓷总体强度比较低，因此用作替代材料时仅能应用在强度较低的部位[11]。此外，虽然HA具有良好的生物相容性和可降解性，但是它极易吸附蛋白质、氨基酸和其他有机质，导致了细菌的滋生，增加植入材料的感染性。为了提高多孔HA陶瓷材料的力学性能并降低其感染性，本研究采用水热法合成载Ag羟基磷灰石粉体(Ag-HA)，以自制的Ag-HA粉体为主要原料，采用添加造孔剂法制备孔隙呈现梯度分布的梯度多孔载Ag羟基磷灰石(Ag-HA)陶瓷。其中Ag+对病毒、真菌和细菌都具有良好的广谱抗菌能力[12]，因此Ag-HA粉体可提高HA基体的抗菌性能。此外，梯度多孔陶瓷两端的孔隙度较大，植入人体后有利于骨组织的长入和体液的传输，中间的孔隙度较小，有利于承担更多的载荷，进而提高多孔HA陶瓷的力学性能。本文重点研究烧结温度、造孔剂含量、载Ag含量对梯度多孔Ag-HA陶瓷孔隙度的影响。研究并观察了烧结产物的物相组成和显微组织，测量了梯度多孔Ag-HA陶瓷的压缩性能和抗菌性能。

1 实 验

实验采用水热法制备载银羟基磷灰石粉体(Ag-HA粉体)，具体工艺条件如下：配置浓度为0.167 mol/L的AgNO3、Ca(NO3)2·4H2O溶液和浓度为0.1 mol/L的(NH4)2HPO4溶液；按照实验设计量将不同体积的AgNO3溶液加入到Ca(NO3)2溶液中，使得载Ag含量(摩尔分数)分别为0.5%(0.5Ag-HA)、1.0%(1.0Ag-HA)和2.0%Ag(2.0Ag-HA)；然后加入0.1 g十二烷基苯磺酸钠，磁力搅拌15 min后再滴入0.1 mol/L的(NH4)2HPO4溶液搅拌30 min；搅拌后加入氨水调节混合溶液pH=10～11。将混合液装入反应釜中，放入烘箱内180 ℃下保温6 h，进行水热反应。待其冷却至室温并静置24 h后将溶液离心，并用乙醇和离子水进行多次洗涤，然后在80 ℃下干燥6 h，制备载Ag含量不同的Ag-HA粉体。Ag-HA粉体的微观形貌和元素组成如图1所示。Ag-HA粉体呈现细棒状，直径在50～100 nm之间，有较高的长径比。由EDS分析可知，Ag掺杂进HA粉体。

图1 不同Ag掺杂的HA粉体的微观形貌照片和EDS分析Fig.1 Microstructure and EDS analysis of Ag-HA powder with the different silver-loaded contents

以自制的Ag-HA粉体为主要原料，以碳酸氢铵为造孔剂，制备梯度多孔Ag-HA陶瓷。实验过程如下：取适量自制的Ag-HA粉体，分别向其中加入下同质量的碳酸氢铵作为造孔剂，并混合均匀，将混合粉末依次逐层放入自制的模具中，造孔剂分布(其占各层的质量分数)为20%(下层)-x%(中间层)-20%(上层)，x分别为0%、5%、10%、20%，使用自动压片机在100 MPa的压制压力下将混合粉末压制成型，压制好的试样在空气中放置24 h，释放压制过程中粉末内部产生的内应力。将处理好的试样放入管式炉中，通氩气作为保护气氛，以3 ℃/min的升温速度加热到200 ℃时保温2 h，再分别升温至1 050 ℃、1 100 ℃、1 150 ℃、1 200 ℃烧结2 h，烧结后随炉冷却降至室温取出。将烧结后的试样打磨抛光，并且对其进行性能检测。

采用阿基米德排水法测量烧结试样的孔隙度。采用日本理学公司生产的Rigaku D/Max-2500/PC型X-射线衍射仪测量梯度多孔Ag-HA陶瓷的物相组成。采用日本HITACHI公司生产的型号为S-3000N的扫描电子显微镜观察试样的微观形貌。使用电子万能试验机对试样进行压缩实验。所测试样尺寸为10 mm×10 mm×10 mm，加载速率为1 mm/min。

抑菌圈测试如下：将无菌的固体培养基加热后倒入装有200 μL的细菌培养皿中，等待培养基凝固。将烧结后的梯度多孔Ag-HA试样(尺寸为φ15 mm×6 mm)放置在培养基上，放入37 ℃生化培养箱中培养24 h，用游标卡尺测量牛津杯和圆块周围的抑菌圈直径。

杀菌率测试如下：在5 mL液体培养基中放入105cfu/mL的菌液50 μL，然后放置梯度多孔载Ag-HA陶瓷样品，并在细菌培养摇床中，37 ℃下分别培养1 h、5 h、9 h、18 h和24 h。培养不同时间后移取菌液进行10倍的稀释并涂于平板上，将平板倒置培养24 h观察平板上的细菌数目得出杀菌率，杀菌率计算公式为：

式中：X为杀菌率;A为对照组细菌数;B为实验组细菌数。

2 结果与讨论

2.1 梯度多孔Ag-HA陶瓷孔隙度分析

2.1.1 造孔剂分布对梯度多孔Ag-HA陶瓷孔隙度的影响

表1是不同造孔剂分布的梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷的孔隙度(压制压力100 MPa，烧结温度1 150 ℃)。从表1中可以看出，当中间层造孔剂含量由0%增加到20%时，试样的孔隙度从18.6%增加到31.2%。这是因为本实验所用的造孔剂为碳酸氢铵，生坯中的造孔剂(NH4HCO3)在烧结过程中以二氧化碳和水蒸气的形式完全挥发，不会对之后的高温烧结造成影响。造孔剂(NH4HCO3)分解后会在原来的位置留下孔洞。当生坯中造孔剂含量较低时，造孔剂挥发后留下的孔洞较少，烧结试样的孔隙度较小。随着造孔剂含量越来越高，造孔剂分解后留下的孔洞也就增多，因此烧结后试样的孔隙度进一步增大。但是造孔剂含量过高会影响Ag-HA颗粒之间的扩散烧结，导致烧结后梯度多孔Ag-HA力学性能下降。

表1 不同造孔剂分布下梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷的孔隙度Table 1 Porosity of gradient porous 2.0Ag-HA ceramic with different pore-forming agent distribution

续表

2.1.2 烧结温度对梯度多孔Ag-HA陶瓷孔隙度的影响

图2 烧结温度对梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷孔隙度的影响Fig.2 Effect of sintering temperature on porosity of gradient porous 2.0Ag-HA ceramic

图2为烧结温度对梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷孔隙度影响的曲线(压制压力100 MPa，造孔剂分布为20%-10%-20%)。由图2可知，当烧结温度从1 050 ℃升高到1 200 ℃时，孔隙度从30.4%减小到23.7%，孔隙度随烧结温度的升高而减小。出现上述现象的原因是梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷样品在进行烧结时，随着烧结温度的升高，颗粒的活性增强，其扩散速度加快，扩散程度更加充分，颗粒间的连接面积更大。此外随着烧结温度提高，烧结驱动力促使晶粒之间吞并长大，最终导致了烧结产物的孔隙度减小。Ag-HA粉体的烧结性能要优于纯HA粉体，其原因如下：在前期Ag-HA粉体制备研究中发现随着载Ag含量的增加，0.5Ag-HA、1.0Ag-HA、2.0Ag-HA粉体的(002)晶面间距从0.343 02 nm增加到0.343 26 nm和0.344 29 nm，这说明Ag+掺杂后会引起HA晶格畸变，而Ag-HA粉体中较多的晶格畸变有利于提高粉末的活性，进而增强原子扩散能力，使Ag-HA粉体更易于被烧结致密。在1 150 ℃烧结2 h后，多孔陶瓷孔壁烧结相对致密。此时，进一步提高烧结温度，对试样烧结致密度的影响不大。考虑到HA材料随着温度升高容易分解，为了尽可能减少HA分解，本实验选择烧结温度为1 150 ℃。

2.1.3 载Ag含量对梯度多孔Ag-HA陶瓷孔隙度的影响

不同载Ag含量的梯度多孔Ag-HA陶瓷的孔隙度如表2所示(压制压力100 MPa，烧结温度1 150 ℃，造孔剂分布为20%-10%-20%)。由表2可知，随着载Ag含量的增加，梯度多孔Ag-HA陶瓷孔隙度略有减小。梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷的孔隙度为24.7%。这是因为Ag掺杂到HA中时，Ag+沿c轴进入晶胞取代Ca2+，由于Ag+(0.115 nm)半径比Ca2+(0.106 nm)半径大，因此HA晶格发生畸变，随着含Ag量增加，晶格畸变加大。这种晶格畸变将导致粉末活性增加，粉末活性越大，烧结过程中颗粒之间的扩散能力越强。在相同温度烧结时，颗粒之间形成的烧结颈越大，试样中孔隙减少，试样被烧结致密。但是载Ag含量对烧结后梯度多孔Ag-HA孔隙度的影响比造孔剂和烧结温度的影响小。

表2 不同Ag含量的梯度多孔Ag-HA陶瓷的孔隙度

2.2 梯度多孔Ag-HA陶瓷物相组成分析

图3为梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷与多孔纯HA陶瓷XRD谱。在图3(b)中，梯度多孔2.0Ag-HA的峰略有左移。以(002)晶面为例，纯HA衍射峰为25.698°，多孔2.0Ag-HA的晶面衍射峰为25.640°，向小角度方向偏移。其原因可能是由于Ag+半径大于Ca2+半径，Ag+掺杂后引起HA晶格畸变，从而使面间距增大，由布拉格方程λ=2dsinθ(λ为入射X射线波长；d为晶面间距；θ为入射角)可知，若X射线的波长不变，当d增加时，θ便会随之减小，所以衍射角会向小角度发生偏移。Ag掺杂HA粉体后，Ag+将HA晶体中Ca2+的位置替代生成了Ca10-xAgx(PO4)6(OH)2(0.5≤x≤2.0)离子固溶体。图谱中未发现造孔剂(NH4HCO3)以及反应产物的衍射峰，说明在高温烧结的过程中造孔剂已完全分解挥发。

图3 多孔HA陶瓷XRD谱Fig.3 XRD patterns of porous HA matrix ceramics

2.3 梯度多孔Ag-HA陶瓷显微组织分析

图4为梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷不同部位的微观形貌照片。其中图4(a)和图4(c)分别是试样上下外表面(造孔剂含量为20%部分)，图4(b)为试样中部(造孔剂含量为10%部分)。

图4 造孔剂含量20%-10%-20%的梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷显微组织形貌照片Fig.4 Microstructure of gradient porous 2.0Ag-HA ceramic with 20%-10%-20% pore-making agent

在图4中明显可以看到，试样外表面的孔隙比内部多。外表面高孔隙结构可以确保Ag-HA基体植入人体后，生物体内的细胞、纤维组织和骨组织的长入，增大生物组织与植入材料的接触面积，而且也能够使生物组织和植入材料之间有更好的结合强度。除此之外，互相连通的孔结构便于营养的运输，可以加快骨修复过程，增强骨缺损修复的能力，有利于骨组织的长入，进而提高界面结合强度。而心部属于低孔隙度区域，对提高多孔Ag-HA的力学性能是十分有利的。图4(d)为孔壁的显微组织照片，在孔壁上存在少量的微孔。这种孔和图4(a)、(b)、(c)中的大孔来源不同，大孔主要来源于造孔剂碳酸氢铵的分解。而孔壁上的微孔，主要来源于初始生坯中的孔隙，也就是Ag-HA颗粒在堆积时存在的微小孔隙。这种孔隙在烧结过程中，随着烧结致密化进程，逐渐减少或者消失。

2.4 梯度多孔Ag-HA陶瓷的力学性能分析

2.4.1 造孔剂分布对梯度多孔Ag-HA陶瓷抗压强度的影响

不同造孔剂含量对梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷材料抗压强度的影响如图5所示(压制压力100 MPa，烧结温度1 150 ℃)。从图5中可以看出，陶瓷试样的抗压强度与造孔剂含量有关，当试样中间层造孔剂含量从0%逐渐提升20%时，烧结后梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷的抗压强度从20.5 MPa减小到8.7 MPa。其原因是：当造孔剂含量较低时，材料的孔洞数目较少，承担外加载荷的面积增大，单位面积的载荷减小，同时孔隙减少使试样内的缺陷也减少，试样能承受更大的载荷，因此烧结后梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷材料的抗压强度较高。将1#(20%-20%-20%)和2#(20%-10%-20%)两种多孔2.0Ag-HA陶瓷样品做比较，两者外层孔隙结构相似，在植入人体后与人体体液接触环境相似，都有利于骨组织的生长，但是前者的抗压强度为8.7 MPa，后者的抗压强度为12.6 MPa，后者的抗压强度比前者提高了44.8%。因此具有梯度孔隙结构的多孔HA陶瓷的抗压性能优于均匀多孔陶瓷。

图5 造孔剂含量对梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷抗压强度影响Fig.5 Effect of pore-making agent contents on compressive strength of gradient porous 2.0Ag-HA ceramic

图6 烧结温度对梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷抗压强度影响Fig.6 Effect of sintering temperature on compressive strength of gradient porous 2.0Ag-HA ceramic

2.4.2 烧结温度对梯度多孔Ag-HA陶瓷抗压强度的影响

烧结温度对梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷抗压强度的影响如图6所示(压制压力100 MPa，造孔剂含量20%-10%-20%)。由图6可知，随着烧结温度逐渐升高，梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷的抗压强度随之增大。当烧结温度从1 050 ℃升高到1 200 ℃时，陶瓷材料的抗压强度从4.8 MPa增加到13.2 MPa。但是超过1 150 ℃后，样品抗压强度增加幅度不大。分析原因如下：当烧结温度升高后，2.0Ag-HA颗粒活性提高，颗粒之间的扩散反应速率加快，颗粒之间形成更多的烧结颈，同时颗粒间的结合强度增加，这种致密的孔壁结构有助于更好地承担外加载荷。同时随着烧结温度的增加，2.0Ag-HA多孔陶瓷的孔隙度也随之减小，内部由于孔洞所形成的微裂纹以及其它缺陷减少，因此多孔陶瓷的抗压强度增加。当烧结温度超过1 150 ℃后，试样的烧结密度增加不明显，因此抗压强度增加幅度也不明显。

2.5 梯度多孔Ag-HA陶瓷抗菌性能分析

2.5.1 Ag含量对梯度多孔Ag-HA陶瓷抑菌圈的影响

不同Ag含量的梯度多孔Ag-HA陶瓷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈如图7所示，抑菌圈直径大小如表3所示。在图7中可以看到梯度多孔Ag-HA周围有抑菌圈出现，而纯多孔HA陶瓷周围没有抑菌圈出现。这表明梯度多孔Ag-HA陶瓷具有明显的抗菌能力，而纯HA并不能对细菌的生长产生抑制或灭杀的作用。从表3中可以看出，当陶瓷中载Ag含量由0.5%增加至2.0%时，大肠杆菌中抑菌圈的直径从16.84 mm增大到20.31 mm，金黄色葡萄球菌中抑菌圈的直径从16.92 mm增大到21.05 mm。这就表明其抗菌能力随载Ag含量的增加而增强，而当载Ag含量较低时，Ag-HA陶瓷对细菌的灭杀效果较弱。分析原因如下：在Ag-HA陶瓷中的Ag+是产生抗菌效果的成分，因此随着试样中的载Ag含量增加，释放到外界的Ag+数量也会增多，从而对细菌有了更好的抑制与灭杀效果。

Ag+具有抗菌性的主要原因是：细菌的细胞壁主要是由肽聚糖和脂多糖组成，Ag+可能通过阻碍聚糖链、短肽，肽桥的形成，使肽聚糖不能正常合成，破坏了细胞壁，使细菌生长受阻。此外，Ag+穿过细胞壁，与细胞膜蛋白质结合，细胞膜蛋白质主要是以内在蛋白和外在蛋白两种形式同膜脂质相结合的，Ag+能够与内在蛋白中的疏水羟基结合使细胞膜蛋白质受损，破坏了细胞内环境的稳定性并阻碍了生化反应的有序进行。同时Ag+与细胞内部蛋白酶的巯基结合，使蛋白酶失去活性，使细菌细胞致死。Ag+也会干扰DNA分子的复制，阻碍细菌繁殖。并且由于某种原因，杀死细菌的Ag+并未随着细菌的死亡而消失，而是回到溶液中，继续对剩余细菌产生作用，保持了试样的抗菌效果。其抗菌模型如图8所示。

图7 不同载Ag含量梯度多孔Ag-HA陶瓷在(1)大肠杆菌和(2)金黄色葡萄球菌中的抑菌圈Fig.7 Inhibition circle images of gradient porous Ag-HA ceramics with various Ag contents immersed in E.coli(1) and staphylococcus aureus(2) bacterial culture medium

表3 不同载Ag含量梯度多孔Ag-HA陶瓷在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的抑菌圈直径

图8 Ag-HA抗菌模型Fig.8 Antibacterial model of Ag-HA

2.5.2 造孔剂含量对梯度多孔Ag-HA陶瓷抑菌圈的影响

图9为中间层造孔剂含量不同的梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌环境下出现抑菌圈形貌图。抑菌圈直径如表4所示。

图9 造孔剂含量不同的梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷在(1)大肠杆菌和(2)金黄色葡萄球菌中抑菌圈形貌照片Fig.9 Inhibition circle images of gradient porous 2.0Ag-HA ceramic with various pore-forming agent contents immersed in E.coli(1) and staphylococcus aureus(2) bacterial culture medium

表4 不同造孔剂含量的梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的抑菌圈直径

从图9和表4中可以看出，梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷周围有明显的抑菌圈出现，当中间层造孔剂含量由0%增加至20%时，大肠杆菌中抑菌圈的直径从19.27 mm增大到21.22mm，金黄色葡萄球菌中抑菌圈的直径从20.19 mm增大到22.13 mm。这说明孔隙度大的多孔陶瓷的抗菌性能略优。分析原因如下：当造孔剂的含量不断增加时，2.0Ag-HA陶瓷的孔隙度逐渐增大，并且这些微小的孔隙具有过滤和吸附的能力，同时2.0Ag-HA陶瓷的比表面积增大，更多的2.0Ag-HA基体与细菌接触，为Ag+的释放提供了便利的条件，增加了Ag+的释放量，因此能够杀死更多的细菌。此外，继续观察72 h内细菌的生长情况，发现抑菌圈里仍未生长出新的细菌，这证明了梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷的抗菌能力具有一定的持久性。在实验中也发现，梯度多孔0.5Ag-HA和1.0Ag-HA陶瓷均随中间层造孔剂含量增加，抑菌圈直径略有增大，抗菌效果略有提高。

2.5.3 载Ag含量对梯度多孔Ag-HA陶瓷杀菌率的影响

将不同载Ag含量的梯度多孔Ag-HA陶瓷试样浸泡在菌液中，培养不同时间，观察细菌生长情况。以载Ag含量为0.5%的梯度多孔0.5Ag-HA陶瓷为例，其实验结果如图10所示，未载Ag的梯度多孔HA块体试样的杀菌率如图11所示。由图10可知，梯度多孔0.5Ag-HA块体试样浸泡培养1 h时，有少量细菌长出，继续培养5 h、9 h、18 h、24 h后，均无细菌出现，而图11中梯度多孔HA块体试样浸泡在菌液中，不同时间培养后均有细菌长出，且细菌数量随培养时间延长越来越多。两者对比，加入载Ag试样的菌液中，细菌只能存活1 h左右，在5 h至更长时间后便被完全灭杀，多孔0.5Ag-HA块体在1 h时的杀菌率已经接近100%，5 h后杀菌率已经达到100%。这说明在较低的载Ag含量时，多孔Ag-HA的短时杀菌效果已经非常理想，并且在24 h后，多孔Ag-HA的杀菌率仍能保持在100%。此外，在对梯度多孔1.0Ag-HA块体和梯度多孔2.0Ag-HA块体进行杀菌实验中，1 h后的溶液中已经没有细菌存活，即杀菌率达到100%，并具有一定的持久性。

图10 梯度多孔0.5Ag-HA陶瓷在大肠杆菌溶液(1)和金黄色葡萄球菌(2)溶液培养不同时间效果图Fig.10 Bactericidal rate maps of gradient porous 0.5Ag-HA ceramis immersed in E.coli(1) and staphylococcus aureus(2) bacterial culture medium for different time

图11 梯度多孔HA陶瓷在大肠杆菌(1)和金黄色葡萄球菌(2)溶液中培养不同时间效果Fig.11 Bactericidal rate maps of gradient porous HA ceramic immersed in E.coli(1) and staphylococcus aureus(2) bacterial culture medium for different time

3 结 论

(1)随着中间层造孔剂含量的增加，梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷的孔隙度增大，抗压强度减小；随着Ag含量和烧结温度的增大，梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷孔隙度减小，抗压强度增强；当造孔剂分布为20%-10%-20%，压制压力为100 MPa，载Ag含量为2%，烧结温度为1 150 ℃时，烧结后梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷孔隙度为24.7%，抗压强度为12.6 MPa。

(2)XRD和SEM分析表明烧结产物为Ag+掺杂的HA相，烧结后样品具有明显的梯度孔隙结构。抗菌实验表明：随载Ag含量和孔隙度的增大，梯度多孔2.0Ag-HA陶瓷对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径的增加，表现出良好的抗菌性。

(3)梯度多孔Ag-HA陶瓷的杀菌率在1 h时接近100%，在5 h、9 h、18 h和24 h后均达到100%，且抗菌效果具有一定的持久性。而纯HA陶瓷未表现出抗菌性能。