钼靶联合hMAM、BRCA-1表达水平检测对乳腺癌的诊断价值

温冰馨，王 斌

中一东北国际医院普外科一科，辽宁沈阳 110021

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率及致死率在全球逐年升高，成为女性发病率最高的肿瘤，在女性恶性肿瘤致死率中高居第六位，成为危害女性健康的第一大杀手[1]。早期诊断乳腺癌具有重要的临床意义。目前，诊断乳腺癌的方法主要为影像学检查，如超声、钼靶检测等，但是对于早期患者的筛选准确率仍有待提高[2-3]。乳腺癌在分子生物学上具有较为特异的表征，如乳腺癌人乳腺珠蛋白(hMAM)基因、乳腺癌易感基因-1(BRCA-1)等，可作为预测乳腺癌发生的高危风险因子[4-5]。本研究分析了钼靶及hMAM、BRCA-1表达水平检测对乳腺癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2019年8月在本院就诊的乳腺癌患者150例纳入肿瘤组，年龄(41.12±4.74)岁；病理类型包括浸润性导管癌88例，原位癌22例，腺癌26例，浸润性小叶癌14例。另选取同期就诊的良性乳腺肿瘤患者100例纳入良性组，年龄(42.09±5.10)岁；病理类型包括乳腺纤维腺瘤78例，乳腺囊性增生病16例，乳管内乳头状瘤6例。两组患者年龄比较，差异无统计学意义(t=1.537，P=0.125)。肿瘤组纳入标准：经病理诊断符合乳腺癌诊断标准[6]的患者；首次诊治患者。肿瘤组排除标准：合并其他类型恶性肿瘤患者；复发转移患者；合并严重肝、肾、心脑血管等疾病患者；孕妇或哺乳期女性。良性组纳入标准：经病理诊断符合良性乳腺肿瘤诊断标准[7]的患者；首次诊治患者。良性组排除标准：合并严重肝、肾、心脑血管疾病患者；孕妇或哺乳期女性。本研究经过本院医学伦理委员会审阅同意，所有患者均签署知情同意书。

1.2方法 两组患者均行钼靶及hMAM、BRCA-1检测，比较两组患者相关参数差异，绘制ROC曲线分析各指标单独及联合检测的诊断价值。(1)钼靶检测：患者取平卧位，进行X射线扫描，对两侧乳房及周围组织显影；阳性的诊断标准为患者肿块显影清晰，与周围组织界限不清，钙化点较为清晰，否则为阴性。每例患者由两位具有5年以上钼靶检测诊断乳腺癌工作经验的医师独立完成，意见不一致时讨论得出一致结果。(2)实验室指标检测：①提取总RNA。取患者静脉血5 mL，弃去开始的1 mL防止其他细胞污染，取1 mg/mL血液标本采用乙二胺四乙酸(EDTA) 抗凝，生理盐水稀释2～3倍，人淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总 RNA。②cDNA合成。设计甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物，并制备反转录反应体系20 μL(总RNA 1 μL+随机引物200 ng+ RNasin 20 U+5×反转录反应缓冲液 4 μL+M-MLV 反转录酶20 U，加无检酸酶的水补充体积至20 μL)，42 ℃反应55 min。③PCR扩增。hMAM以GAPDH为内对照，BRCA-1以β-微球蛋白为内对照，取反转录反应产物2 μL，0.2 μL的三磷酸脱氧核苷(dNTP，10 nmol/L)，0.15 μL 牛血清清蛋白(BSA，10 μg/μL)，0.5 μL引物(10 μg/L)，MgCl21 μL(25 mmol/L)，0.1 μg DNA聚合酶，1 μL水解探针(3 μg/L)，焦碳酸二乙酯(DEPC)-水(H2O)(加至10 μL)。条件为95 ℃ 3.5 min，95 ℃ 10 s；退火55 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，45个循环。根据标准曲线，7500 Fast Sequence Detector分析仪自动计算出标本中hMAM、 BRCA-1与GAPDH、β-微球蛋白的表达水平，并计算hMAM、BRCA-1与GAPDH的比值。反应中所涉及的反转录反应体系、PCR反应体系及7500 Fast Sequence Detector分析仪为美国ABI公司生产。引物设计及合成采用 PE公司Primer Express软件设计引物和探针，引物由上海基康生物技术有限公司合成。诊断标准：hMAM及BRCA-1表达水平在受试者工作特征(ROC)曲线cut-off值上方即为阳性，下方为阴性。

2 结 果

2.1两组钼靶检测结果比较 肿瘤组钼靶检测阳性率为68.7%(103/150)，良性组为27.0%(27/100)，差异有统计学意义(χ2=41.730，P<0.05)。

2.2两组hMAM、BRCA-1表达水平比较 肿瘤组hMAM表达水平明显高于良性组，差异有统计学意义(t=49.723，P<0.05)，肿瘤组BRCA-1表达水平明显低于良性组，差异有统计学意义(t=30.632，P<0.05)。见表1。

表1 两组各项实验室指标表达水平比较

2.3钼靶、hMAM及BRCA-1表达水平单独和联合检测的诊断性能 以钼靶检测及hMAM、BRCA-1表达水平作为检验变量，是否诊断为乳腺癌为状态标量，以1—特异度为X轴，以灵敏度为Y轴绘制ROC曲线，见图1。根据ROC曲线可得，联合检测的灵敏度明显高于各指标单独检测，且联合检测的AUC明显高于各项指标单独检测，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 单独及联合检测对乳腺癌的诊断性能比较

图1 ROC曲线分析

3 讨 论

以往研究表明，乳腺癌早期诊断能明显改善患者生存率[8]，但目前临床缺乏其早期筛查的有效手段，因此，探索简单、有效、非侵入性的早期乳腺癌检查方法具有重要的临床意义。影像学检查，如钼靶检测在乳腺占位性病变的检查中有独特的优势，操作简便，重复性强[9]。同时，乳腺癌在分子表型上具有特异性表征，约40%的乳腺癌患者存在hMAM及BRCA-1过度表达，因此，进行乳腺癌相关基因的表达检测也可为其诊断提供重要的依据[10]。

钼靶检测是乳腺癌诊断的常用方法，通过放射性显影观察病灶形态、大小、部位、与周围组织关系、边缘、钙化等特征，以此判断病灶的良恶性，具有操作简便、重复性好等特点[11]。含笑等[12]的研究表明，簇状钙化、肿块及两者合并是乳腺癌钼靶检测结果的3个重要特征。本研究中，钼靶检测诊断乳腺癌的灵敏度为68.7%，特异度为73.0%，AUC为0.792。阳君[13]的研究表明钼靶检测诊断乳腺癌的准确率为72%，结果与本研究接近。但进一步分析发现，钼靶检测在筛选具有一定典型病灶形态的乳腺癌中具有优势，但是对于一些存在非特异变化的良性病变可能会产生误诊，而对于小病灶、不典型的病灶可能会造成漏诊，需要联合其他指标提高诊断效能。

hMAM是乳腺癌相关基因，在人体第11号染色体上，正常情况下在成人的乳腺组织表达，而在乳腺癌细胞中可过度表达，因此，临床可依据其表达水平进行乳腺癌的诊断[14]。BRCA-1在人体第17号染色体上，正常情况下作为一种抑癌基因参与细胞周期调控、细胞增殖及损伤修复等过程，突变后可见表达水平降低或缺失，与乳腺癌、卵巢癌的发生密切相关[15]。本研究中，hMAM表达水平诊断乳腺癌的cut-off值为6.32×105copy/mL灵敏度为57.3%，特异度为82.0%，AUC为0.753(95%CI:0.697～0.809)；BRCA-1表达水平诊断乳腺癌的cut-off值为0.55×105copy/mL，其对应的灵敏度为60.7%，特异度为61.0%，AUC为0.642(95%CI:0.572～0.711)。hMAM、BRCA-1表达水平诊断乳腺癌是针对发生了相关基因突变的乳腺癌的诊断，但这些只是乳腺癌中的一部分，会产生漏诊；因此，hMAM、BRCA-1表达水平诊断乳腺癌的灵敏度较低，单独诊断价值有限。

既往研究表明，联合多种方法诊断乳腺癌可提高其检出率[16]。本研究中钼靶、hMAM、BRCA-1联合诊断乳腺癌的灵敏度(78.7%)明显高于单项检测的灵敏度(68.7%、57.3%、60.7%)，差异有统计学意义(P<0.05)；联合检测在提高乳腺癌检测灵敏度的同时，还保持了较高的特异度(79.0%)，联合检测的AUC明显高于单独检测，表明联合检测可提高乳腺癌的检出率，具有较好的临床应用前景。结合前文，钼靶检测诊断乳腺癌灵敏度较低，特异度较高，存在漏诊的情况；而hMAM、BRCA-1表达水平诊断灵敏度低，诊断性能有限，因此，将三者联合可提高乳腺癌的诊断灵敏度，同时保持较高的特异度，明显提高了诊断性能。