碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的实验室研究及与临床转归相关危险因素分析

贾艳增，马玉兰，陈 莹，时东彦

（1.河北医科大学第二医院检验科，石家庄 050000；2.石家庄第四医院检验科 ，石家庄 050017）

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumonia,KPN)是临床常见的条件致病菌，在新生儿、老年人和免疫功能低下的患者引起广泛的疾病，包括肺炎、尿路感染、血流感染等。然而，高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella Pneumonia,HvKP）是一种日益被认识的病原菌，比普通的肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella Pneumonia,cKP）更具有毒性，可导致健康的年轻人致病，包括肝脓肿、肺炎、脑炎等严重的社区获得性感染，具有侵袭性[1]。由于抗生素的不规范使用以及毒力质粒、耐药质粒在细菌之间快速传播，目前出现了高毒力碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent and carbapenem-tesistantKlebsiella pneumonia,CR-HvKP）[2]，CR-HvKP具有HvKP 的特性，极强的侵袭力，极易播散，造成血流感染、胸腔感染、腹腔及眼内炎、中枢神经系统的感染及其它器官的感染，导致严重的感染[3-5]。CR-HvKP 检出率不断增加，不但给治疗带来困难，同时显著增加了临床治疗难度,成为临床中导致患者死亡的重要因素[1，6]。不同地区CR-HvKP感染情况和致死情况不同,本研究针对河北医科大学第二医院CR-HvKP 的实验室检测及临床转归相关危险因素分析。

1 材料及方法

1.1 研究对象 回顾性分析河北医科大学第二医院2016年12月～2017年12月高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌20例，其中来自痰/肺泡灌洗液标本16例，腹腔引流液 1例，血培养3例。

1.2 仪器与试剂 全自动微生物鉴定仪：法国生物梅里埃公司Vitek2 Compact，聚合酶链反应（PCR）扩增仪（美国Bio-Rad 公司），凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司），电泳仪（上海康华公司），细菌DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），2×Taq Master Mix（北京康为科技有限公司），50×TAE 缓冲液（上海生工有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 收集临床资料：选取2016年12月～2017年12月CR-HvKP感染20例患者为研究对象，记录患者年龄、住院天数、临床抗生素治疗方案及治疗效果、感染严重程度（如感染性休克）评估等因素。

1.3.2 菌株鉴定及药敏试验：采用法国生物梅里埃公司全自动微生物鉴定仪Vitek2 Compact 进行菌株鉴定及药敏试验,采用E-test 法进行替加环素的药敏试验，药敏结果判定标准参照CLSI2016年进行判读药敏结果；质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603，大肠埃希菌ATCC25922。

1.3.3 高黏液表型检测：采用拉丝试验方法，用接种环挑取血琼脂平板上新鲜菌落进行牵拉，黏液丝形成且长度≥5mm则判断为高黏液表型阳性，黏液丝形成且长度＜5mm 判断为阴性。

1.3.4 高毒力肺炎克雷伯菌菌株：参照文献[7-8]资料，采用PCR 检测毒力基因(rmpA，rmpA2)、血清型（K1，K2）、碳青霉烯酶基因（KPC-2，NDM-1，OXA，VIM 和IMP）。

1.3.5 碳青霉烯酶表型检测：用接种环刮取受试菌株并加入2ml TSB 中，再将10μg 美罗培南纸片浸入菌悬液中，然后用无菌棉签蘸取大肠埃希菌ATCC25922 菌悬液（0.5 麦氏浊度单位）均匀涂抹于M-H 琼脂平板上，最后将药敏纸片从菌悬液中取出，贴在该M-H 琼脂平板上。结果判读：抑菌圈直径6～15mm 或在16～18mm 抑菌圈内存在菌落，则碳青霉烯酶阳性。

1.3.6 血清杀伤试验：将肺炎克雷伯菌悬液中放入人血清抗体，接种于Mueller-Hinton 琼脂板，接种后1h 菌量在10%～100%之间，3h 后＜10%为高敏感；1h 内过度生长＞100%，2h 后或3h 后＜100%为中敏感；1h，2h 及3h 后均过度生长＞100%为抵抗组。

1.4 统计学分析 采用 SPSS21.0 统计软件对研究数据进行统计学分析,计量资料用均数±标准差（±s）（年龄、住院天数）表示，采用t检验；计数资料用频数表示，采用卡方（χ2）检验或Fisher 确切概率法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 20 例CR-HvKP感染患者的实验室检测结果 见表1。20例CR-HvKP感染患者中男性17例，女性3例，标本来源主要为痰/肺泡灌洗液16例（80%）。毒力基因rmpA2 均为阳性，拉丝试验阳性17例（85%），血清杀伤试验均为抵抗组，K2型血清型16例（80%），碳青霉烯酶基因KPC-2型18例（90%），碳青霉烯酶表型mCIM 均为阳性。

表1 20例CR-HvKP感染患者的实验室检测结果

2.2 20 例CR-HvKP感染患者临床转归相关危险因素分析 见表1。20例CR-HvKP感染患者中治疗好转9例，治疗无效11例，治疗有效率为45%，治疗好转组与治疗无效组年龄比较,差异无统计学意义（t=1.446，P＞0.05)；两组在气管插管辅助呼吸、并发症危及生命的感染性休克比较,差异均有统计学意义(χ2=7.593，5.690，均P＜0.05)。

表2 20例CR-HvKP感染患者临床转归相关危险因素的分析

3 讨论

目前国内外临床实验室判定HvKP 主要根据拉丝试验阳性[9-10]，但本研究显示并不是所有的HvKP拉丝试验均为阳性,因此本研究根据文献[7-8]通过毒力基因rmpA/rmpA2 阳性并通过血清杀伤试验抵抗组确定为HvKP。

过去观点认为HvKP 很少对抗生素产生耐药性，除了天然耐药氨苄西林,大多数菌株对常用药物均敏感，但近年来研究发现HvKP 存在多种结合和整合元素，使毒力基因/耐药基因在细菌之间通过质粒传播[11-14]。目前，主要有两种途径形成CR-HvKP:一种是碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-ResistantKlebsiella pneumoniae，CRKP） 通过质粒获得毒力基因而形成CR-HvKP；另一种为HvKP 通过质粒获得碳青霉烯酶基因形成的[13]，且可以在细菌之间快速传播[14-15]。CRHvKP 具有高毒性、耐多药和传播性的特点被称为真正超级细菌，给临床治疗和医院感染控制带来巨大的挑战，因此需要迫切的对这种新型菌进行实验室检测及临床转归相关危险因素分析是十分必要的。

本研究结果显示，碳青霉烯酶基因以KPC-2型为主，与DONG 等[16]报道一致。血清型以K2 为主，与SIU 等[17]报道一致，而ZHANG 等[18]在2016年报道过5例K1 血清型的CR-HvKP，而杜芳玲等[19]在2019年报道过2例K1型CR-HvKP 与2例K2型的CR-HvKP，提示目前K1、K2 血清型均出现了CR-HvKP，而在我院以K2 血清型为主，这种K2型CR-HvKP 存在的具体机制有待进一步深入研究。mCIM 试验用于检测碳青霉烯酶表型确认的方法，具有非常高的敏感度和特异度[20]。研究结果显示，20例CR-HvKP 菌株中均为阳性，其中2株未检测出携带碳青霉烯酶基因，与文献[21]报道一致，具体原因尚不清楚。

研究结果显示，20例CR-HvKP感染患者中，治疗好转为45%，目前临床对CR-HvKP 抗感染治疗选择的药物非常有限，往往选择联合治疗。美罗培南联合替加环素病例最多，治愈率为为42.9%，低于WU 等[22-24]报道替加环素治疗碳青霉烯耐药的肠杆菌治愈率为51.6%，提示美罗培南联合替加环素临床治疗效果没有预期理想，可能和患者的基础疾病及药物的联合治疗药效有关，其机制有待进一步研究。美罗培南联合多黏菌素由于例数较少，临床意义不足。尽管体外药敏试验对替加环素敏感，但长期使用这种抗生素(单独使用或与其他几种抗生素联合使用)，甚至多粘菌素B，都不能从血液中根除这种微生物，导致致命的结果[21]。目前有一些新的药物逐渐上市（头孢他定-阿维巴坦等），希望对此类细菌有更好的体内杀菌效果。

进一步分析临床资料显示20例CR-HvKP感染患者住院天数平均＞30天，住院时间较长。本研究还进行了治疗好转与治疗无效患者使用气管插管呼吸机辅助呼吸、感染性休克比较差异有统计学意义，提示气管插管呼吸机辅助呼吸以及引起危及生命的感染性休克并发症影响治疗效果，因此该医院20例CR-HvKP 的临床治愈率极差，即使治愈，治愈的用药天数、感染严重程度远高于普通肺炎克雷伯菌感染。因此对于此类患者的预后评估非常复杂，要综合基础疾病，辅助治疗，药物选择等综合判断。

CR-HvKP 具有高侵袭性、致病力强以及高耐药限制了临床有效药物治疗，使临床面对治疗CRHvKP感染相当的困难，造成CR-HvKP感染的高死亡率且细菌的传播性强，因此应引起高度重视。