高通量测序技术检测孕早期自然流产绒毛样本染色体异常发生的Meta分析

辛淑文，杨少哲，胥 博，滕少侠，李荣香，付秀虹

（漯河市中心医院生殖医学与遗传中心，河南漯河 462000）

自然流产（spontaneous abortion，SA）指非自然状态下发生的流产，是妇产科的一种常见病，近年来的调查发现其发生率约占临床妊娠的15%～20%。SA 的病因有以下几个方面：遗传因素、子宫解剖异常、免疫因素、内分泌因素、感染因素等。其中染色体异常占50～60%，为主要因素[1]。近年来，研究胚胎染色体的技术日新月异。该类技术中，最先被应用的是染色体核型分析技术，后来因绒毛样本易被污染和培养周期长等缺点，而被荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridizatio，FISH）补充和完善。而到目前为止，应用广泛的基因芯片技术、高通量测序（Next Generation Sequence，NGS）技术等。其中，NGS 技术因其通量高、价格低廉等优势，在各个医院被广泛应用。但是，由于医院的研究人群分散、地域差异及各研究平台不同等原因，造成孕早期SA 染色体异常率有差异。因此，本研究主要通过对2014年1月～2017年12月发表的共12篇文献进行荟萃分析，进而对NGS 技术检测孕早期自然流产绒毛样本的染色体拷贝数变异情况进行一次宏观评价，为临床提供更全面的指导建议。

1 材料与方法

1.1 资料来源

1.1.1 纳入标准：①研究对象：所纳入的样本为早期流产绒毛样本（孕周＜16 周）；②研究采用高通量测序方法对流产绒毛样本染色体拷贝数变异情况进行检测；③自然流产诊断明确：停经史，血液和尿液HCG 阳性，Torch 检测为阴性，无有害物质接触史，超声提示：无心管搏动；④研究限中文或英文。

1.1.2 排除标准：①孕周＞16 周；②采用其它检测方法对样本进行染色体拷贝数变异情况检测（如：基因芯片技术，染色体核型分析技术等）；③无法获取原始数据文献；④重复数据发表文献数据小/不全；⑤数据来源不清晰等。

1.2 方法

1.2.1 检索策略：根据关键词检索中国知网期刊数据库（CNKI）、万方数据库（WangFang Data）、维普中文科技期刊数据库（VIP）、Pubmed 数据库、EmBase 数据库等中英文数据库，检索时限为2014年1月1日～2017年12月31日。

中文检索词包括：稽留流产、自然流产、胚胎停育、高通量测序技术、染色体拷贝数变异等。英文检索词包括：missed abortion，spontaneous miscarriage，pregnancy loss，high throughput genetic technology，chromosomal copy number variant 等，以及这些词的自由组合检索。

1.2.2 文献筛选：按照上述检索词对文献进行查找，遵循所设定的纳入与排除标准，根据题目和摘要对研究进行初筛。全文阅读初筛通过的文章并提取原始数据。两名研究人员独立筛选然后交叉核对，如有歧义，通过共同讨论或请求第三方协商。

提取内容包含文献发表基本信息、研究起止年份、研究地区、主要研究结果等。经两人核对一致后录入。

文献确定后根据卡斯尔-渥太华量表（the Newcastle-ottawa scale，NOS）对文献质量进行评价，NOS 满分为9分，以≥5 分为高质量研究。

1.3 统计学分析 采用Revman 4.3 软件进行Meta分析。通过Homogeneity test（Q 检验）检验进行异质性分析（检验水准α=0.05），同时结合I2定量判断异质性的大小。若P≥0.05 且I2≤50%，提示研究结果同质，采用固定效应模型进行Meta分析；若P≤0.05 且I2≥50%，提示研究结果异质，采用随机效应模型进行Meta分析。通过 Egger’s 检验来评价可能存在的发表偏倚。Meta分析的检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 检索结果 首次检索共检出179篇相关文献（中文115篇，英文64篇）。剔除重复文献67篇，剩余112篇。这112篇文献通过阅读题目或摘要剔除90篇，剩余22篇。通过阅读全文剔除10篇（孕周大于16 周或不予提供的有6篇，无法提取有效数据2篇，综述1篇，2018年文献1篇），最终得到12篇符合标准的文献[2-13]。纳入文献特征见表1。

表1 纳入文献基本特征

2.2 Meta分析结果所有12篇文献共包含自然流产患者723例。各文献纳入研究对象差距较大，最少为15例[7]，最多为119例[11]。在对各文献中阳性样本数、染色体数目异常、微缺失/微重复的OR值进行统计合并，异质性检验发现上述三组数据中各独立研究之间均存在异质性（P＜0.05），因此采用随机效应模型进行合并。

2.2.1 染色体总体异常率：见图1。纳入的12篇文献中，总样本例数723例，染色体异常共计477例。不同文献报道的染色体异常率差异较大，最低52%，最高94%。随机效应模型Meta分析结果显示，孕早期自然流产绒毛样本染色体异常率（95%CI）为68%（0.58～0.76）。

图1 胚胎流产绒毛样本染色体阳性结果在总样本例数的发生率

2.2.2 染色体数目异常率：见图2。纳入的12篇文献中，染色体数目异常共计347例。不同文献报道的染色体数目异常率差异较大，最低30%，最高67%。随机效应模型Me ta分析结果显示，孕早期自然流产绒毛样本染色体数目异常率（95%CI）为50%（0.43～0.57）。

图2 流产绒毛样本染色体数目异常在总样本例数的发生率

2.2.3 染色体微缺失/微重复异常率：见图3。纳入的11篇文献中（其中一篇无微缺失/微重复发生），染色体微缺失/微重复异常共计130例。不同文献报道的染色体数目异常率差异较大，最低3%，最高41%。随机效应模型Meta分析结果显示，孕早期自然流产绒毛样本染色体微缺失/微重复异常率（95%CI）为16%（0.09～0.24）。

图3 流产绒毛样本染色体微缺失/微重复在总样本例数的发生率

2.3 发表偏倚分析 用Egger's 检验评价纳入研究的偏倚风险，其结果见图4，均P＞0.05。未发现所有的结局指标存在发表偏倚，其结果受发表偏倚的影响可能性较小。

图4 漏斗图

3 讨论

近年来，自然流产发生率约占临床妊娠的15%～20%，给社会和家庭带来沉重的精神和经济负担。随着遗传学的发展，自然流产绒毛样本的染色体拷贝数变异检测应用越来越广泛。其中，CHEN 等[14]发现胚胎染色体数目异常在孕早期自然流产病人中所占比例高达50%，其中16 号染色体数目异常竟占总异常率的30.6%。SAHOO 等人[15]采用基因芯片技术分析了美国8 118个胚胎组织（其中83%为发生自然流产的胚胎），53.7%的子代表现为染色体异常。染色体异常在早期流产绒毛样本检测占据这么重要的地位，无疑给自然流产的诊治提供了新思路。

本研究纳入12篇文献，723例自然流产样本，发现染色体异常率为68%，略高于辛淑文等[16]研究的56.4%。两研究的数目异常率相同，均为50%。本研究的微缺失/微重复异常率为16%，同样略高于辛淑文等[16]研究的13.28%。可能与辛淑文等[16]的研究中将小于4Mb 异常称为微缺失/微重复，而微缺失/微重复片段大于4Mb 的染色体异常定义为染色体结构异常有关。染色体微缺失/微重复同样是患儿多发畸形的主要原因[17]。本Meta分析纳入的研究覆盖地域较广，各研究的样本量较小，高通量测序平台多样等原因也可能是导致结果和单一文献结果有差别的原因。

2005 年，454 Life Sciences 公司最先推 出了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，奠定了第二代测序技术的基础。NGS 技术较传统Sanger 测序法有三大优势[18]：第一，可在数百万个点上同时阅读测序，因此也称之为大规模平行测序（massively parallel signature sequencing,MPSS）；第二，具有完美的定量功能；第三，成本低廉。基于NGS 技术的优势，遂被逐渐应用于医学领域。近年来，逐渐被各大医院用于对遗传性疾病的诊断工作[17,19]。

所纳入文献染色体异常率存在差异的原因，主要有以下几个方面：①人群地域特征；本研究所纳入人群大多集中在北方地区。可能受南北方地域差异、人们意识及经济发展水平的影响，导致所纳入人群有差异。因文献数量有限，未对南方和北方进行亚组分析。希望通过本研究可为今后进一步比较地域差异打下基石。②各研究的测序仪器不同，本研究所使用的测序仪器主要有Hiseq2000，Nextseq CN500 等，可能在测序深度和结果取舍方面存在差异；③各研究所纳入的样本例数存在差异；④取材方面：绒毛样本取材特殊性，不同部位取材可能会影响实验结果。

本系统评价采用无对照研究的Meta分析方法[20]，对NGS 技术检测早期流产绒毛染色体异常率进行合并分析，了解染色体整体异常率，数目异常率，微缺失/微重复异常率的发生情况，为自然流产寻找遗传学因素。本研究发现孕早期自然流产绒毛样本染色体异常率68%，染色体数目异常率为50%，染色体微缺失/微重复异常率为16%。合并结果表明高通量测序技术可以作为检测孕早期绒毛样本染色体是否异常的重要手段，染色体异常是孕早期自然流产的重要原因。