输卵管性不孕患者与生殖道感染不同沙眼衣原体基因型和cHSP60表达水平的相关性初步研究

杨艳华，肖光文，罗晓东

（嘉应学院医学院，广东梅州 514031）

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)所致的泌尿生殖道感染是目前临床最为常见的性传播性疾病之一，女性感染后往往表现为盆腔炎、宫颈炎、输卵管阻塞，严重的可导致输卵管性不孕（tubal factor infertility，TFI）。引起泌尿生殖道感染 CT 的主要基因型别为 D～K型，目前对CT 的致病性与基因型是否相关的认识并不统一[1-3]，其致病能力强弱与基因型别是否关联存在分歧，而尤其对于不同CT基因型导致TFI 是否存在差异，鲜有文献报道。衣原体热休克蛋白 60（chlamydial heat shock protein 60,cHSP60）是CT 的一个重要的致病因子，尤其与TFI 关系密切[4-5]。本文通过研究对比TFI患者与其他原因不孕患者不同基因型CT 感染情况及感染者生殖道标本中cHSP60 的水平，探讨不同基因型CT 与TFI 的相关性，为进一步探明CT 导致TFI 的机制提供资料。

1 材料与方法

1.1 研究对象 采用前瞻性队列研究2018年1月～2019年6月梅州城区所在的梅州市人民医院、梅州市妇幼保健计划生育服务中心和嘉应学院附属医院三家医院收集的妇科或生殖中心就诊和体检的CT阳性女性不孕患者宫颈分泌物标本和资料。根据不孕原因分成TFI 和其他原因不孕，TFI 的纳入标准[6]：①夫妇同居 1年或以上，保持正常的性生活并未采取任何避孕措施，女方仍未能受孕；②男方精液分析各项指标正常、精子穿透试验为阳性；③女方连续 3个月卵泡 B 超监测发育正常且有成熟卵泡排出；④女方经期第2～3日基础性激素水平正常； ⑤子宫输卵管造影术（HSG）显示子宫腔大小和形态正常，一侧或双侧输卵管管壁显示不完全或完全阻塞； ⑥免疫性不孕（抗精子抗体等）血清系列检测正常。其他原因不孕纳入标准为符合条件①和②，但HSG 显示为双侧输卵管通畅的患者。

1.2 仪器与试剂 ABI 9600 PCR 核酸扩增仪购自美国ABI 公司，Biotek ELx808 酶标仪购自美国伯腾公司，ESCO 生物安全柜购自新加坡ESCO。QIAamp DNA Mini Kit 核酸提取试剂盒购自德国QIAGEN GmbH-Hilden 公司，巢式PCR CT-Omp1基因检测试剂盒购自中山达安基因公司，cHSP60 ELISA试剂盒购自美国 RB 公司。

1.3 方法

1.3.1 标本的采集：妇科医师使用阴道窥器先使宫颈暴露，取一个拭子将过多的黏液揩去后，取另一拭子在宫颈管内口1～2 cm 处旋转一周并停留 20 s，避免碰及阴道壁的情况下将拭子慢慢拔出，置于盛有 1 ml 无菌生理盐水的冻存管中，反复挤压拭子1 min 至衣原体全部脱落，弃除挤干的拭子并立即保存标本于-70 ℃。

1.3.2 巢氏PCR 检测CT 的Ompl 基因型：分离标本上清液并用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取核酸，严格按照试剂盒说明书进行操作。然后按参考文献[3]的操作步骤采用巢式PCR 扩增CT 外膜蛋白 Omp1 基因的 VD1-VD3 并测序分型。

1.3.3 酶联免疫吸附 (ELISA) 法检测标本上清中cHSP60 的表达：经巢氏PCR 检测CT 阳性的患者标本，将分离的上清，采用 cHSP60 ELISA试剂盒检测 cHSP60 的表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学分析 数据采用 SPSS21.0 软件进行统计和分析。计数资料采用卡方检验进行分析，计量资料若符合正态分布的，以均数 ± 标准差(±s)表示，采用t检验进行分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的CT 阳性检出率和阳性检出者资料比较 收集TFI 患者254例，其中CT 阳性37例，阳性率为14.6%；其他原因不孕患者635例，CT阳性31例，阳性率为4.9%，两组患者CT 阳性率差异有统计学意义(χ2=24.091，P＜0.001)。

2.2 TFI 与其他原因不孕患者中CT基因型分布情况 见表1。TFI与其他原因不孕患者均检出了D，E，F，G，H，I，J 和K 基因型，未见其他型别基因型。其中TFI 患者中最常见的基因型为E，F 和J型，3种基因型共计23例，占62.2%（23/37），存在2例两种基因型混合感染，其中1例为D和F 的混合感染、另1例为E和J型的混合感染;其他原因不孕患者中最常见的基因型为G型和D型，2种基因型共计18例，占58.1%（18/31）。TFI 与其他原因不孕患者基因型分布的比较，差异有统计学意义(χ2=16.958，P=0.031)。对各基因型在TFI 与其他原因不孕患者中所占比率进行比较，其中G型在其他原因不孕患者中所占比率显著高于其在TFI 患者中的所占比率，差异有统计学意义(χ2=7.732，P=0.007)。

2.3 CT 阳性的TFI 与其他原因不孕患者生殖道中cHSP60表达水平 CT 阳性的TFI患者生殖道中cHSP60表达水平为111.5±15.0 ng/L，显著高于CT 阳性的其他原因不孕患者的103.5±9.9 ng/L，差异有统计学意义(t=2.754，P=0.008)。

2.4 不同CT基因型TFI 患者cHSP60表达水平的比较 见表2。在TFI 患者中，其中感染E，F 和J基因型患者平均表达水平为116.5±14.9 ng/L，明显高于感染D和G 基因型患者(101.8±9.8 ng/L)，差异有统计学意义(t=3.984，P＜0.001)。

表1 TFI 与其他原因不孕患者中CT基因型的分布情况[n(%)]

表2 不同CT基因型TFI 患者cHSP60表达水平之间的比较(±s )

表2 不同CT基因型TFI 患者cHSP60表达水平之间的比较(±s )

基因型 n cHSP60 (ng/L) 合计 cHSP60 (ng/L) t值 P值E 8 118.8±18.2 23 116.5±14.9 3.984 ＜0.001 F 8113.1±11.0 J 7 118.5±14.2 D 3 101.2±5.3 6 101.8±9.8 E 3 102.2±12.4

3 讨论

CT所致的生殖道感染是目前最常见的性传播疾病之一，其发病率分别4 倍于淋病和20 倍于梅毒[7]，CT 感染者中女性约占70%，又以15～34岁的性活跃者为主[8]，感染后可导致包括子宫颈炎、输卵管阻塞、慢性盆腔炎等常见妇科疾病，并且容易引起TFI 的发生。其主要机制为CT 感染后可通过阴道宫颈经输卵管蔓延到整个盆腔从而引起盆腔急性炎症发作，严重时引起输卵管腔粘连闭塞及积液，甚至出现系膜组织及肠管、输卵管与子宫广泛粘连而导致不孕。

在不同CT基因型引起泌尿生殖道感染的相关研究中，有文献[9]表明F型引起的宫颈黏液脓细胞显著低于E型，但由F型引起的子宫内膜疾病发生率更高，还有文献报道女性出现下腹痛的概率与F型CT 的表达更密切[10]。本研究显示，在TFI 人群与其他原因不孕人群中CT 的检出率组间差异有统计学意义，而且两组人群在不同CT基因型的分布比较差异亦有统计学意义。这表明不仅CT 及其不同基因型的感染可能与TFI 的发生存在某些关联。近年的分子流行病学研究结果表明[5,7,13]，不同国家和地区，不同的族群CT基因型的分布都是有显著差异的，全球各国流行的相对优势基因型主要为E，D和F型。本研究中，梅州地区不孕人群中相对优势的基因型除了E，F 和J，还包括G，D，H和K型，这和杨斌等[3]研究的广东三市的基因型分布结果相似。

cHSP60 是热休克蛋白gro-EL 家族同系物，它与真核生物HSP60 约有50%的同源性，与人HSP60 氨基酸顺序的同源性为48%。cHSP60 是CT 的主要致病物质之一，是导致机体免疫损伤的重要抗原，是适应性免疫的主要靶点，可诱导前炎症因子合成出现宫颈上皮细胞的凋亡[14]。高水平的 cHSP60 可通过信号转导激活Th1 和Th2 分泌相关炎症因子诱导了炎性反应，是导致输卵管纤维化和管腔闭塞的重要原因，这种持续的免疫反应是永久性不可逆的输卵管损伤的重要原因[15]。因此，cHSP60 和TFI 密切相关，其生殖道中的表达水平对于评价CT 的致病能力有一定的价值。本研究显示TFI 患者生殖道中cHSP60 的表达水平显著高于其他原因不孕患者，其中感染E，F 和J 基因型的TFI 患者生殖道中cHSP60 的表达水平明显高于感染D和G 基因型的TFI 患者，这进一步证实了不同CT基因型与TFI 存在相关性的可能，E，F 和J型可能是相比D和G型能更高表达cHSP60 的基因型，从而更容易引起TFI。

本文只是从不同CT基因型与TFI 的相关性和生殖道cHSP60 的表达水平展开的初步研究，而这些都受患者人群、患者的个体差异和CT 感染的时效性等诸多因素的影响，不同CT基因型间毒力是否存在差异，是否某些型别与TFI 更密切，还需要通过更大样本量的临床调查和动物实验等进行更周密的研究。

综上所述，TFI 患者CT 感染的主要基因型可能为E，F 和J，而其他原因不孕患者CT 感染的主要基因型可能为D和G型，不同CT基因型感染可能与TFI 有关，E，F 和J型可能是与TFI 最密切的基因型，但要进一步了解CT基因型与TFI 的关系和机制，还需深入研究。