53株耐碳青霉烯类药物粘质沙雷菌的耐药表型分析

张燕 周万青 李佳 郑洁 高硕 张之烽 孟玲宁 曹小利 沈瀚 张葵

粘质沙雷菌作为医院内的重要致病菌，可造成住院患者发生肺炎、泌尿道感染、败血症以及外科手术感染。近年来随着碳青霉烯类抗生素在临床广泛使用，耐碳青霉烯粘质沙雷菌的临床分离率和耐药率正逐步上升[1，2]，给临床治疗带来很大困难。产碳青霉烯酶是细菌耐碳青霉烯类药物的主要耐药机制[3]。本文调查分析本院粘质沙雷菌的耐药情况，并对其耐碳青霉烯类药物的可能机制进行探讨，为临床抗感染治疗提供一定依据。

材料与方法

1 菌株来源 收集南京大学医学院附属鼓楼医院2018年6月～2019年9月临床分离的非重复粘质沙雷菌235株。所有菌株经Vitek 2 Compact及配套GN鉴定和GN13卡检测药物敏感性。筛选出同时对美罗培南和亚胺培南耐药菌株53株，样本分布包括痰液48株（90.7%）、血液3株（5.7%）、分泌物1株（1.8%）、胸水1株（1.8%）。科室分布为神经外科31株（58.5%）、ICU 12株（22.6%）、急诊病区7株（13.2%）、呼吸内科2株（3.8%）和老年科1株（1.9%）。大肠埃希菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146为本实验室保存菌株。

2 主要仪器及试剂 Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定分析仪及配套GN和GN13板卡、MALDI-TOFMS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（法国梅里埃生物公司）；2720型PCR扩增仪（Applied Biosystems公司）；电泳仪及GelDoc XR型凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）；血平板和MH平板（赛默飞公司）；药敏纸片（Oxoid）；胰蛋白酶大豆肉汤（青岛海博生物技术公司）、EDTA（上海生工）；2×Taq Mix（DBI公司）；PCR引物合成及序列测定由上海生工公司合成；琼脂糖干粉（法国Biowest公司）；100 bp DNA Marker（大连Takara公司）。

3 细菌鉴定与药敏试验 使用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定分析仪配套GN板卡鉴定菌株，并用MALDI-TOF-MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪复核菌株。使用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定分析仪配套GN13板卡检测药物敏感性，同时使用纸片扩散法进行复核。依据CLSI M1002019版判定标准进行结果判读[4]。

4 碳青霉烯酶表型筛选 改良碳青霉烯酶灭活试验（mCIM）：依据CLSI M1002019[4]，用1 μL接种环取血平板上过夜培养的菌落加入2 mL胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中乳化。涡旋震荡10～15 s。将10 μg美罗培南纸片加到每个细菌悬液管中，确保整个纸片浸没在悬液中，35℃孵育4 h。用10 μL接种环捞出美罗培南纸片并沥干多余液体，将其贴在已涂布0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922的MH平板上。35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直径。结果判定：①碳青霉烯酶阳性：抑菌圈直径6～15 mm或在16～18 mm抑菌圈内有针尖状菌落；②碳青霉烯酶阴性：抑菌圈直径≥19 mm；③碳青霉烯酶不确定：抑菌圈直径16～18 mm或者抑菌圈直径≥19 mm但抑菌圈内有针尖状菌落。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706分别作为阳性和阴性质控菌株，同时做空白对照。EDTA-改良碳青霉烯酶灭活试验（eCIM）：标记另一支2 mL胰蛋白酶大豆肉汤（TSB），加入20 μL 0.5 mol/L EDTA溶液；余下步骤同上述mCIM步骤。结果判定：mCIM试验阳性为前提；①金属-β-内酰胺酶阳性：eCIM与mCIM结果相比较，美罗培南抑菌圈直径相差≥5 mm；②金属-β-内酰胺酶阴性：eCIM与mCIM结果相比较，美罗培南抑菌圈直径相差≤4 mm。对于eCIM，任何抑菌圈内的针尖状菌落均忽略不计。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146和ATCC BAA-1706分别作为阳性和阴性质控菌株，同时做空白对照。

5 细菌DNA模板提取 挑取血平板过夜培养的菌落2～3个，于250 μL无菌水中研磨混匀后，金属浴加热煮沸15 min，12000 r/min 离心5 min，将上清液转移至无菌微量离心管中，-20℃保存备用。

6 耐药基因PCR与测序 参照文献[5]合成碳青霉烯酶基因引物，见表1。反应体系20 μL：2×Taq 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应条件根据不同的碳青霉烯酶基因略有差异。配制10 g/L琼脂糖凝胶，对PCR扩增产物进行电泳，凝胶成像系统观察结果并保存图片。委托生工生物工程有限公司进行PCR扩增产物测序，基因序列经NCBI网站BLAST程序进行比对。

7 统计学处理 应用WHONET 5.6软件对MIC药敏结果、K-B法的药敏结果进行统计分析。

表1 PCR引物序列及扩增片段长度

结 果

1 药敏结果 235株粘质沙雷菌对亚胺培南的耐药率为25.6%，对头孢哌酮/舒巴坦、头孢曲松、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率分别为35.1%、35.3%、31.2%、36.2%、31.6%。对阿米卡星、复方新诺明的耐药率分别为1.0%、3.2%，见表2。其中检出同时对美罗培南和亚胺培南耐药粘质沙雷菌53株，其对头孢曲松、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率均大于98%，对阿米卡星、复方新诺明的耐药率分别为1.7%、1.6%，对美罗培南均耐药，见表3。

表2 235株粘质沙雷菌对常见药物耐药情况

表3 53株耐碳青酶烯粘质沙雷菌对常见药物耐药情况

2 碳青霉烯酶表型筛选结果 53株待测菌株mCIM全部阳性；eCIM阳性3株。

3 PCR检测碳青霉烯酶基因结果 53株菌株中检出blaKPC基因51株，检出blaNDM基因1株，1株同时携带blaKPC和blaNDM基因。53株均未检出携带blaIMI、blaOXA48、blaFOX、blaIMP、blaVIM基因。经测序，blaKPC基因均为blaKPC-2基因，blaNDM基因均为blaNDM-1。基因分布情况见表4。部分blaKPC基因扩增产物凝胶成像图见图1，部分blaKPC基因扩增产物测序图见图2。

表4 53株耐碳青酶烯粘质沙雷菌耐药基因分布

图1 部分blaKPC基因扩增产物凝胶成像图

图2 部分blaKPC基因扩增产物测序图

讨 论

本调查显示，粘质沙雷菌已经成为呼吸道感染的主要病原菌，特别在神经外科和重症监护室。碳青霉烯类抗生素是目前治疗多重耐药革兰阴性杆菌的一线药物，随着抗菌药物广泛应用，碳青霉烯类耐药菌株的检出不断增多，形势严峻[6]。本院调研期间检出的235株粘质沙雷菌对亚胺培南的耐药率为25.6%，对头孢哌酮/舒巴坦、头孢曲松、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率均在30%以上。对阿米卡星、复方新诺明的耐药率分别为1%和3.2%。与相关文献报道[7]相比，本院耐碳青霉烯粘质沙雷菌的检出率相对较高，对头孢曲松、氨曲南、喹诺酮类药物的耐药率也明显高于文献报道。

所分离的53株耐碳青霉烯粘质沙雷菌的科室分布以神经外科为主，这可能与患者进行侵入性手术以及长时间大剂量使用抗生素有关。分离出耐药菌株的样本以痰液为主，由此可见，粘质沙雷菌的感染主要以呼吸系统感染为主[8]。药敏结果显示对头孢曲松、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率均大于98%，对阿米卡星、复方新诺明的耐药率分别为1.7%、1.6%，提示在此类细菌感染时可选的抗生素种类有限；对头孢他啶的耐药率为17%，敏感率为43.4%，这与袁园等的报道[9]不符，具体的机制尚待进一步研究。

粘质沙雷菌对碳青霉烯类耐药的主要机制是产生碳青霉烯酶[10]。依据Ambler分子分类，可分为A、B、D三大类。A类主要包括NMC、IMI、SME、KPC、GES等，在体外可以被克拉维酸和他唑巴坦抑制水解活性；B类主要包括NDM、IMP、VIM、GIM、SPM等，可以被EDTA等金属离子整合剂抑制，故B类又称金属酶；D类又称OXA酶，不能被酶抑制剂和EDTA 抑制，对碳青霉烯类药物的水解活性较弱。通过碳青霉烯酶表型检测发现，53株碳青霉烯类耐药粘质沙雷菌mCIM试验均阳性，eCIM试验仅3例阳性。进一步基因检测发现，53株菌株均检出碳青霉烯酶基因，其中51株携带blaKPC-2基因，1株携带blaNDM-1基因, 1株同时携带blaKPC-2和blaNDM-1基因。由此可见，mCIM试验对KPC酶的敏感性较高；而对于3株eCIM试验阳性菌株，2株携带blaNDM-1基因，另1株可能携带其他B类碳青霉烯酶基因。由此可见，blaKPC-2基因是介导本院粘质沙雷菌对碳青霉烯类药物耐药的主要流行基因型，与文献报道一致[11]。

综上所述，本院耐碳青霉烯粘质沙雷菌的检出率较高，blaKPC-2基因是介导本院粘质沙雷菌对碳青霉烯类药物耐药的主要流行基因型，应引起临床重视，注意谨慎、合理、规范地使用抗菌药物，从而控制耐药性的播散，做好院内感染防控。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突