1,3-D-半乳糖基转移酶p.Arg187Cys突变导致形成ABx亚型*

曾一梅 雷航 王钰箐 龚淞颂 王学锋 蔡晓红 邹纬

1900年发现的人类第一个血型系统——ABO血型系统，被认为是输血医学及组织移植中最重要的血型系统[1-3]。ABO基因包含7个外显子，主要编码两种不同的糖基转移酶，1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶（A糖基转移酶，GTA）和1,3-D-半乳糖基转移酶（B糖基转移酶，GTB）[4，5]。ABO基因多态性或突变可导致酶活性或特异性改变而影响ABO表型[6],从而引起ABO血型血清学鉴定中正反定型不一致，定型和配血困难。既往在中国人群中发现的1,3-D-半乳糖基转移酶p.Arg187Cys突变个体表型为正常B型[7]。本研究探究该突变导致ABO血型正反定型不符和AB亚型的可能分子机制。

对象与方法

1 标本来源 健康中国籍个体，男性，汉族，ABO血型鉴定时发现正反定型不符。使用EDTA-K2抗凝管采集外周静脉血5 mL进行血清学和分子生物学方法检测。

2 方法

2.1 检测试剂：单克隆抗-A和抗-B、抗-A1血清、抗-H血清和ABO反定型红细胞和筛选红细胞（均购自上海血液生物医药有限责任公司）；血液基因组DNA提取试剂盒（天根生物产品）。DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒（GeneMark产品）。

2.2 血型血清学检测：ABO正反定型和抗体筛查使用Galileo全自动血型分析仪（Immucor公司，美国）进行初次检测。采用试管法进行ABO血型复检，参照国际公认的实验室标准操作方法进行[8]。血清学亚型分类标准按文献判断[9]。

2.3 基因组DNA的提取和扩增：采用天根生物血液基因组DNA提取试剂盒，严格按照说明书提取患者外周血基因组DNA。对ABO基因的增强子、启动子和所有7个外显子及其侧翼序列进行PCR扩增。PCR扩增引物、扩增条件根据参考文献[10，11]设计，引物由上海生工生物技术有限公司合成，见表1。PCR扩增反应程序为：预变性95℃3 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃60 s共30个循环；后置72℃延伸8 min。

表1 用于扩增和测序ABO基因片段的引物

2.4 PCR扩增产物测序：利用DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒（GeneMark产品）严格按照试剂说明书纯化扩增的PCR产物, 委托上海生工生物技术有限公司对纯化扩增的PCR产物进行直接测序和克隆后测序分析。

2.5 突变对GTB蛋白结构影响的预测：对ABO*B基因突变c.559C＞T导致的1,3-D-半乳糖基转移酶突变GTB-R187C进行结构分析。GTB以人类1,3-D-半乳糖基转移酶的晶体（PDB ID：2RJ8）结构为分子模型，采用Chimera软件（版本1.1University of California,SanFrancisco，CA）进行突变体构建，并对突变后的分子结构进行分析[12]。GTA蛋白3D结构图的绘制采用PyMol软件[DeLano,W.L.the Py MOLMolecular Graphics System（2003-2011），版本1.4.1，De Lano Scientific,San Carlos，CA]。

2.6 突变与等位基因命名法：根据国际输血协会（ISBT）的命名方式对突变和ABO等位基因进行命名。

结 果

1 血清学实验结果 ABO正定型时,与单克隆抗-A、抗-B、抗-A1和人源抗-A强凝集4+,与人源抗-B反应2+，与抗-H反应为1+（抗-H与Bc反应1+，与Oc反应2+）；反定型时血浆与标准A细胞和O细胞不凝集，与标准B细胞和两份新鲜B细胞弱凝集。血清学表现为正反不符，不规则抗体筛查未见异常，疑似ABx亚型，见表2。

2 PCR纯化产物直接测序和克隆后测序分析 对该个体进行ABO基因扩增与测序显示，该个体ABO基因第7外显子在第559位碱基存在C＞T杂合突变（见图1），该突变导致精氨酸被半胱氨酸替换。克隆后测序结果显示，该突变位于B等位基因上。检索ISBT血型抗原等位基因数据库显示存在c.559C＞T（p.Arg187Cys）突变的等位基因为ABO*B.03等位基因。

表2 血清学及基因测序结果

图1 标本PCR测序结果

3 对GTB空间模型的分析 从3D结构模型分析可看出，在野生型中，除Arg187的主链O和Met191的主链H形成氢键外，Arg187的侧链H还与Gly176的主链O形成氢键（图2B）；而在突变体R187C中，Cys187的主链O只与Met191的主链H形成氢键，不存在其他的氢键作用（图2C）。说明R187C突变减弱了局部的氢键网络，可能因此导致酶活性下降。

图2 野生型GTB和p.R187C突变体GTB的3D结构比较

讨 论

根据国际输血协会（ISBT）的定义，我们通常所说的血型是指使用人类同种抗体检测到的红细胞上的表面抗原，它们是由基因所决定的一种遗传性状[13]。而ABO血型抗原的特异性是由红细胞表面的ABH物质的多糖链结构决定的，是通过修饰多糖前体H物质产生的。如果基因的改变降低了酶的活性或者改变其亚细胞位置[6]，从而减少H物质到A或者B物质的转换，可能会导致弱A或B的亚型表现型。目前已知与ABO亚型有关的ABO基因突变有点突变、缺失、插入和基因重组等多种[14]。此外,某些ABO杂交酶可以导致同时合成多态性A和B抗原，从而产生所谓的cisAB或B（A）表型[6]。

该个体在血清学表型上疑似ABx，主要是通过反定型B细胞的凝集发现异常的。虽然正定型初筛时使用单克隆抗-B检测到B抗原并未减弱，但是在复检时使用人源抗-B检测发现该个体的B抗原较正常表达B抗原的对照细胞有所减弱。综合多份B细胞与待检样本血浆的反应以及抗筛结果可以看出，血浆中存在不规则抗-B。本例H抗原未明显增强，有研究发现AB型中如果B抗原为亚型而A抗原正常，则不会存在大量H抗原[15]。以上三个特征符合ABx表型的初步判断。我们进一步通过对血样进行ABO基因测序分析来确定ABO亚型。测序结果发现，其ABO基因B等位基因第559位碱基存在C＞T杂合突变，该突变导致187位精氨酸（Arg）被半胱氨酸（Cys）替换。Arg是碱性极性氨基酸，含有一个带正电荷的胍基，倾向于结合供体尿苷二磷酸（UDP）的磷酸阴离子，对维持蛋白的总电荷平衡具有重要作用。而半胱氨酸是一个中性极性含巯基的氨基酸，侧链较Arg短[16]。该突变使Cys187的主链O和Met191的主链H形成氢键外不存在其他的氢键作用，而在野生型中，除Arg187的主链O和Met191的主链H形成氢键外，Arg187的侧链H还与Gly176的主链O形成氢键。说明R187C突变减弱了局部的氢键网络，可能因此导致酶活性下降。研究表明，氨基酸位点的改变会影响糖基转移酶的结构稳定性，进而影响酶的活性或功能改变，从而造成ABO表型变弱[17]。

值得注意的是，既往在中国人群中发现的1,3-D-半乳糖基转移酶p.Arg187Cys突变个体表型为正常B型[7]，而我们发现的该个体在血清学表型为ABx。这很可能是由于该突变导致的1,3-D-半乳糖基转移酶活性减弱较为轻微，在没有1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶共同竞争底物H抗原的情况下，相应红细胞上B抗原量的减少也不明显，导致采用高效价单克隆抗血清的常规定型时未见异常。而在AB型个体中，携带该突变的B基因与A基因共表达，在1,3-N-乙酰氨基半乳糖转移酶的竞争作用下表现出弱B表型，而血清中产生了不规则的抗-B抗体，从而得以发现。通过对这一突变与ABO表型关联性的分析我们可以看出，ABO基因的突变型与ABO表型的对应关系并不完全一致，还需要结合个体的双倍型等位基因的情况综合考虑。

ABO血型不合的输血可能引起急性血管内溶血、肾功能衰竭甚至是死亡。同样的，ABO血型不合的器官移植与急性体液排斥反应相关[18]。因而血型鉴定结果的正确与否将直接影响到输血和器官移植安全，利用分子生物学技术，不仅可以克服血型血清学方法的局限性[19]，也能进一步了解其机制，为临床安全用血和器官移植提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突