邓 强,程 烨,苏江涛,柯贤炳
(1 湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北 武汉 430068; 2 武汉生物工程学院药学院,湖北 武汉 430068)
紫草(Arnebiaeuchroma)为紫草科植物新疆紫草或内蒙紫草的干燥根,作为药物,始载于《神农本草经》[1]。紫草的有效成分主要有两大类:一类是以萘醌类成分为主的脂溶性成分,另一类是以多糖为主的水溶性成分[2]。其中萘醌类成分具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用[3-5],其提取方法的研究对相关产品的开发和利用具有重要的现实意义。萘醌类成分极性较小,常用的提取溶剂有石油醚、氯仿等有机溶剂和植物油[6-7]。从产品开发的角度考虑,本研究首次选用了橄榄油为提取溶剂。橄榄油是世界公认的优质植物油,含有多种天然生理活性物质[8],通过提取萘醌类成分制作成的紫草油、紫草膏或润唇膏等,在中药化妆品的开发上将有较大的应用前景。
响应面法(Response surface methodology,RSM)是一种常用于优化中药材提取条件的方法。其运用数学函数进行分析,同时讨论各因素之间的相互作用,从而得出最优的实验条件,具有精度高、预测值精准的优点。本研究采用响应面法优化紫草中总萘醌的提取工艺,为紫草中萘醌类成分的进一步开发、利用提供理论依据。
粉碎机(吉首市中诚制药机械厂);超声机(济南巴克超声波科技有限公司);离心机(湖南凯达科学仪器有限公司);UV1800型-紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。
新疆紫草(湖北辰美中药有限公司);左旋紫草素对照品(中国药品生物制品鉴定所,纯度>98%,供鉴别使用);橄榄油(广州欧博化妆品有限公司,化妆品级别);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)。
2.1.1 对照品溶液称取左旋紫草素对照品2.5 mg于50 mL容量瓶中,用95%乙醇溶解并定容,即得质量分数为0.05 mg/mL的左旋紫草素对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液称取适量紫草中药饮片,粉碎过3号筛,得紫草粗品,精密称取紫草粉末1.0 g,置于100 mL的烧杯中,加入40 mL橄榄油于40 ℃下浸泡4 h,取上述橄榄油1 mL于10 mL容量瓶中加95%乙醇定容,即得。
2.2.1 紫草含量检测波长的选择精密吸取1 mL左旋紫草素对照品溶液和紫草供试品溶液于不同10 mL量瓶中,用无水乙醇定容,摇匀静置,以无水乙醇为对照,在200~800 nm波长下扫描,以波长为横坐标,吸收值为纵坐标。结果表明,溶液吸光度在516 nm波长处较大,故选择516 nm为检测波长。紫外-可见光谱图见图1。
(a)左旋紫草素对照品
2.2.2 标准曲线的绘制及线性范围考察分别精密移取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL左旋紫草素对照品溶液,于10 mL容量瓶中,用无水乙醇定容,摇匀静置,以无水乙醇为对照,在波长为516 nm处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标(y)、浓度为横坐标(x),绘制标准曲线。得到左旋紫草素对照品的回归方程为y=20.96x+0.0292(r2=0.9988),紫草检测质量浓度线性范围为0.01~0.03 mg/mL。
精密量取上述样品供试液2 mL,按“2.2.2”项下的操作方法,再计算出样品中总萘醌的量。
2.4.1 料液比对总萘醌得率的影响精密称取1 g紫草粉末,共5份,置锥形瓶中,依次加入10、20、40、60、80 mL的橄榄油,在25℃的条件下,浸泡4 h,每个样品中取1 mL加入10 mL的无水乙醇超声3 min,于3000 r/min离心。由图2可知,随着橄榄油体积的增加,总萘醌得率先上升后下降,当橄榄油的体积为40 mL时,得率最高,故选择料液比20、40、60 g/mL为后续优化参考水平。
图 2 料液比对总萘醌得率的影响
2.4.2 提取时间对总萘醌得率的影响精密称取1 g紫草粉末,共5份,置锥形瓶中,加入20 mL橄榄油,在25 ℃下分别浸泡1、2、4、6、8 h,在每个样品中取1 mL加入10 mL的无水乙醇超声3 min,于3000 r/min离心。由图3可知,浸泡时间在4 h的时候,总萘醌的得率最高,故选择2、4、6 h为后续优化参考水平。
图 3 提取时间总萘醌得率的影响
2.4.3 提取温度对总萘醌得率的影响精密称取1 g紫草粉末,共5份,置锥形瓶中,加入20 mL橄榄油,分别在20、40、60、80、100 ℃下浸泡4 h,在每个样品中取1 mL加入10 mL的无水乙醇超声3 min,于3000 r/min离心。由图4可知,随着提取温度的升高,总萘醌得率先升高后下降,当温度为50 ℃时得率达最高,故40、50、60 ℃为后续优化参考水平。
图 4 提取温度对总萘醌得率的影响
2.5.1 方案设计及实验结果根据单因素试验,综合考虑影响紫草总萘醌得率的3个因素,即料液比(A)、提取时间(B)和提取温度(C),采用Box-Behnken法设计实验方案,做响应面的优化研究。用-1、0、1分别表示因素的低、中、高三个水平,设计3因素3水平的响应面分析实验。实验因素及水平见表1,方案设计及结果见表2。
表1 实验因素及水平
表2 响应面分析实验设计与结果
2.5.2 模型的建立及显著性检验采用Design-Expert.10.0.7软件进行多元回归拟合分析,以紫草总萘醌含量(Y)为响应值对料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)进行多元线性回归和二次多项式方程拟合,得回归方程为:
Y=2.30+0.047A-0.071B-6.25×
10-3C+0.013AB-0.038AC-0.06BC-
0.17A2-0.09B2-0.28C2
方差分析结果见表3。
表3 方差分析表
由表3可知,该模型的P<0.01,表明该回归模型是显著的,用该模型对紫草中总萘醌的提取工艺进行分析验证是合理的。失拟项P=0.2990>0.05,说明未知因素对试验结果的干扰很小,可以利用该模型确定最佳提取工艺条件。
2.5.3 响应面优化图及分析采用Design-Expert.10.0.7软件进行分析,得出相应的响应面图。由图5三维图可以发现,当料液比在1∶35~1∶45范围内时,总萘醌的得率随温度的升高逐渐下降;等高线图呈椭圆形,说明料液比和提取温度之间的交互作用显著;图6等高线图呈圆形,说明提取时间和料液比之间的交互作用不显著;由图7三维图可以发现,当提取时间一定时,总萘醌的得率随温度升高逐渐下降,等高线图呈椭圆形,说明提取温度和提取时间之间的交互作用显著。因此在合适的料液比、提取温度、提取时间下,紫草中总萘醌的得率会出现极大值。
图 5 料液比和温度响应面图
图 6 料液比和时间的响应曲面图
图 7 时间和温度的响应曲面图
2.5.4 验证实验通过Design-Expert.10.0.7软件对模型求解方程,得到最优提取工艺条件,料液比1∶42.49,提取温度46.05 ℃,提取时间4.04 h,在该条件下总萘醌含量达到最大值2.32%。为便于实际操作,将总萘醌的提取工艺调整如下,料液比1∶42,提取温度46 ℃,提取时间4 h。在此条件下平行进行3次验证试验,得率分别为2.22%、2.31%和2.25%,测得总萘醌平均得率2.26%,与模型预测值2.32%接近,表明该工艺条件稳定、可靠,同时也说明建立的回归模型合理。
本研究采用Box-Behnken响应面法优化紫草中总萘醌的提取工艺。研究表明,随着温度的升高或浸泡时间的延长,紫草中总萘醌得率都呈现先升高后下降的趋势,推测其可能是紫草中蒽醌类结构不稳定导致。有报道称,紫草素具有光不稳定性,萘醌类结构中的羟基也使紫草素易被氧化[9-10]。本研究首次采用橄榄油作为提取溶剂。橄榄油是一种安全的食用油且含有多种天然的生理活性物质,如VE、VK和类胡萝卜素等[11],在开发一些中药应用产品时具有协同或增效的价值,并且本研究在紫草中总萘醌的提取上,采用橄榄油浸泡提取法,其操作简单,得率较高,具有实际应用价值。
综上所述,本研究采用橄榄油作为溶剂,通过Box-Behnken设计-响应面法成功优化了紫草中总萘醌的提取工艺,优化后的提取工艺合理可行。