石斛属部分植物SRAP-PCR反应体系的建立与优化

张迎辉 杜溶讫 凡莉莉 杨旺利 荣俊冬 郑郁善 陈礼光

摘  要：建立石斛属（Dendrobium）植物SRAP-PCR反应体系，为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术基础。采用单因素及正交试验对反应体系中的各因子进行优化，确定最优退火温度，并筛选有效引物。结果表明：适用于石斛属植物SRAP最佳的反应体系为：Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，10×PCR buffer 2.5 μL，其余用灭菌后的ddH2O补足至25 μL。最优扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，36 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循环;94 ℃变性1 min，根据不同引物的不同退火温度复性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循环;最终72 ℃延伸7 min，保存于4 ℃恒温箱中。应用所建立的优化反应体系成功地筛选出15条多态性较高的引物。

关键词：石斛属;SRAP;反应体系;优化

中图分类号：Q75      文献标识码：A

Abstract： The purpose of this study was to establish an optimized SRAP system for some species of Dendrobium.Single factor and orthogonal test designs were applied to optimize five factors， Mg2+， dNTPs， Taq DNA polymerase， primer and template DNA concentration， in the SRAP amplification system.Due to different species， the concentrations of Mg2+， dNTPs， Taq DNA polymerase， primers and template DNA in the SRAP reaction system were different， and the annealing temperature and the number of cycles in the amplification program also affected the experimental results， and finally the selection and establishment of Dendrobium SRAP optimal reaction system and amplification procedure was： Mg2+ 2.5 mmol/L， dNTPs 0.25 mmol/L， Taq DNA polymerase 1.25 U， primer 0.4 μmol/L， template DNA 30 ng， and the rest were filled with ddH2O. A total of 25 μL of amplification system was formed. The optimal amplification procedure was： pre-denaturation for 5 min at 94 ℃， denaturation for 1 min at 94 ℃， renaturation for 1 min at 36 ℃， extension for 1 min at 72 ℃， 5 cycles， denaturation at 94 ℃ for 1 min， depending on the annealing temperature of the different primers refolding for 1 min， extending at 72 ℃ for 1 min， 30 cycles， and finally extending at 72 ℃ for 7 min， stored at 4 ℃ constant temperature. A total of 15 primers with high polymorphism were successfully screened out by the optimized reaction system.

Keywords： Dendrobium; SRAP; reaction system; optimization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.004

石斛属（Dendrobium）为兰科（Orchidaceae）植物最大的一个属，包含约1500～1600个种，其中我国分布有76种。虽然我国石斛属资源在世界上的占有率比较低，但对于药用方面的开发与利用一直走在前沿。药用石斛的基原植物主要包含铁皮石斛（D. officinale）、金钗石斛（D. nobile）、马鞭石斛（D. fimhriatum）及其近似种[1]。石斛作为我国传统类滋补的中药，在生津益胃和清热滋阴等方面具有功效显著的特点，被视为保健祛病的优品[2]。现代药理学研究表明石斛中主要含有多糖、联苄类、菲类等多种化学成分，其在抗肿瘤、抗氧化等方面功效良好，具有较高的药用价值[3]。随着价格的不断上升，市场出现种质混杂、真伪鉴定困难等问题[4]。在石斛种质鉴定方面，传统的性状分析需要有长期的经验才能判断[5]，显微分析前期处理过程比较复杂，应用范围较窄，只能对显微结构有明显区别的品种进行鉴定[6-8]，理化分析研究范围局限于不同化学成分、性状相似而且没有明显显微特征的石斛[9-10]。随着现代分子生物学的快速发展，DNA分子标记技术已被广泛应用于物种亲缘关系鉴别、基因库构建、指纹图谱库等领域[11-14]。分子标记技术可检测植物不同生长发育时期的任何组织器官，具有多态性高、遗传稳定、数量大等优势[15]。目前，DNA分子标记在石斛属分类鉴定方面得到广泛应用，段媛媛等[16]对铁皮石斛和霍山石斛（D. huoshanense）进行ISSR鉴定体系的建立与优化，可用于2种石斛的鉴别;赵庭梅等[17]研究表明基因组SSR标记在铁皮、迭鞘（D. denneanum）和金釵石斛种间具有较好的转移性，在种内具有良好的多态性，为石斛的遗传研究和分子辅助育种提供依据。SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism）标记法是一种新型的分子标记方法，具备多态性高、引物使用效率较高、简单快捷、分布均匀等优点。本试验建立了适用于石斛属植物SRAP-PCR反应体系，并筛选出有效的引物，为石斛的品种鉴定与分类提供理论和技术基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  植物材料  供试的32种石斛样品采自于福建省福安旺盛经济林研究所石斛种质资源圃（表1）。每种石斛取样7～10株，每株取3～5片新鲜嫩叶，装入塑料自封袋中，用变色硅胶（硅胶与叶片体积比例至少为10∶1）迅速干燥放入冰盒中，快速将干燥的样品带回实验室，并于?80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.1.2  仪器  主要仪器包括Mastercycler pro梯度基因扩增仪、DYY-8C电泳仪、JS-680D凝胶成像分析仪、NanoDrop2000C紫外分光光度计等。

1.1.3  试剂  10×PCR buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶、dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）试剂购于大连TaKaRa公司;DNA梯形标记（100 bp）、6×loading Buffer购自生工生物工程（上海）股份有限公司;低电渗琼脂糖（Agarose）、核酸染料（GoodViewTM）购自北京赛百盛基因技术有限公司;羟基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）、三氯甲烷、无水乙醇等为国产分析纯。SRAP引物选取8条上游引物和7条下游引物，均由尚亚生物技术有限公司合成。

1.2  方法

1.2.1  SRAP-PCR原初反应体系及反应程序的建立  参考颜平[18]和司更花[19]研究的兰科植物SRAP反应体系，石斛的SRAP初始扩增反应体系如下设定：25 μL的扩增体系中含有2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L MgCl2，300 μmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶1 U，上下游引物各0.4 μmol/L，模板DNA为30 ng。初始反应程序设定为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，36 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循环;94 ℃变性1 min，51 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循环;最终72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.2  初始引物的筛选  选择一个DNA模版对56对引物进行初筛，从中挑选条带清晰、重复良好、稳定性较好的多态性引物，最终选择的上游引物为Me1，下游引物为Em3。引物的碱基序列见表2。

1.2.3  石斛SRAP-PCR反应体系的单因素试验  设计  不同浓度Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA进行依次试验（表3），研究各因子对SRAP反应的影响。引物选择上游引物为Me1，下游引物为Em3。

1.2.4  石斛SRAP-PCR反应体系的正交试验设计  对Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA等5个因素开展正交试验（表4）。反应体系为25 μL，引物选择上游引物为Me1，下游引物为Em3，含有2.5 μL 10×buffer，其余用灭菌后的ddH2O补足。

1.2.5  扩增反应程序退火温度及循环次数的优化  利用单因素试验筛选出石斛SRAP-PCR反应体系的最优退火温度和循环次数，其中循环次数设定6个水平，分别为28、30、32、35、38、40次。退火温度设定12个水平，分别为39.9、40.4、41.7、43.5、45.8、48.4、51.1、53.8、56.2、58.1、59.5、60.1 ℃。

1.2.6  SRAP-PCR扩增产物检测  取8.5 μL依据优化的反应体系和扩增程序得来的PCR产物与1.5 μL 6×loading Buffer充分混匀，加到含有核酸染料（GoodViewTM）的1.2%的琼脂糖凝胶中，电泳45 min，电压设为120 V，电流设为120 A，电泳结束后将凝胶放入紫外凝胶成象分析仪中检测拍照。

2  结果与分析

2.1  Mg2+浓度的筛选

不合理的Mg2+浓度会大大降低引物和DNA的结合效率，影响DNA和PCR产物的解链温度，从而产生引物二聚体降低产物的特异性[20]。设定8个Mg2+浓度梯度，如图1所示，当Mg2+浓度小于或等于1.0 mmol/L时，无条带出现，当Mg2+浓度为2.5～4.0 mmol/L时，扩增条带数一致，从降低试验成本考虑，反应液中Mg2+最佳浓度确定为2.5 mmol/L。

2.2  DNA浓度的筛选

通常DNA浓度的高低会直接影响扩增试验的效果，出现无扩增产物或者扩增产物不稳定的现象[21]。但本研究发现不同的DNA浓度均能扩增出清晰明亮的条带（图2），为节省成本，选定模板DNA的最适浓度为10 ng。

2.3  dNTPs浓度的筛选

dNTPs作为PCR扩增的基础，参与新链DNA的合成，对PCR反应结果产生显著的影响，选择最佳dNTPs浓度对PCR反应至关重要[22]。如图3所示，当dNTPs浓度为0.05～0.15 mmol/L时，扩增的条带数量较少且模糊不稳定;当dNTPs浓度为0.35～0.40 mmol/L时，扩增条带数量少，所以综合考虑选定dNTPs的最佳浓度为0.20 mmol/L，此时条带数量多、稳定且清晰。

2.4  Taq DNA聚合酶濃度的筛选

Taq DNA聚合酶浓度过高易出现非特异性条带，并增加试验成本，其浓度过低会影响新链合成效率，甚至无扩增[23]。当Taq DNA聚合酶浓度为0.25～0.75 U和1.50～2.00 U时，扩增的条带数量少且模糊，当浓度为1.00 U时，扩增的条带数量多且清晰（图4），所以选定Taq DNA聚合酶的最佳浓度为1.00 U。

2.5  引物浓度的筛选

在SRAP-PCR扩增反应中引物的作用是与DNA模板特异性结合，引导新链的合成，其浓度主要影响扩增产物的质量，浓度过高会产生错配与非特异性产物扩增，提高引物二聚体的形成，浓度过低则无法进行有效扩增[24]。当引物浓度为0.1～0.2 μmol/L时，条带较少且模糊;当浓度为0.3～0.8 μmol/L时，条带稳定且清晰（图5），综合成本考虑，选定最佳引物浓度为0.3 μmol/L。

2.6  正交试验设计的直观分析

对石斛SRAP-PCR反应体系的正交试验设计结果进行分析，结果表明，处理7、处理8、处理12扩增的条带多且清晰，处理1、2和处理13、14扩增的条带较少且模糊，扩增的效果较差（图6）。参照田艳伶等[25]的方法，依据PCR扩增反应后条带的数量多少和条带的明暗度、清晰度来进行评分，最佳产物记16分，最差的计1分。2次重复分别独立统计，16种处理的分数评定分别为：3、14、13、12、1、11、15、16、2、6、7、10、4、5、8、9;5、6、12、10、9、11、13、16、1、7、8、15、2、3、4、14。

依据平均分值进行直观分析与方差分析（表5），极差R反应出各试验因子对SRAP反应体系的影响，R值越大，则影响越显著[25]，因此，各试验因子对SRAP-PCR反应体系的影响依次为：dNTPs>Mg2+>Taq DNA聚合酶>引物>模板DNA;而ki则反应各试验因子不同水平对反应体系的影响大小，ki越大则对反应体系越有效。因此，在正交试验设计极差分析中，SRAP-PCR标记的反应体系的最优条件为：Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 60 ng，共25 μL体系。

2.7  循环次数和退火温度对SRAP扩增的影响

对循环次数设定6个梯度，分别为28、30、32、35、38、40次，如图7所示，当循环次数为38次时，扩增的条带数量最多且清晰。

利用建立的最佳扩增体系，选择上游引物为Me1，下游引物为Em3，对其退火温度进行梯度筛选，当退火温度在40～60 ℃时，自动设定的梯度温度分别为39.9、40.4、41.7、43.5、45.8、48.4、51.1、53.8、56.2、58.1、59.5、60.1 ℃。当退火温度为39.9、40.4、41.7、43.5、45.8、48.4 ℃时，扩增的条带较模糊且数量少，当退火温度为51.1、53.8、56.2、58.1 ℃时扩增条带虽然清晰但数量少，当退火温度为59.5 ℃时，其扩增的条带数量多且清晰（图8），因此，选定59.5 ℃作为上游引物为Me1，下游引物为Em3的最佳退火温度。按此方法进一步确定了15对有效引物的最优退火温度（表6）。

2.8  SRAP有效引物筛选及反应体系的检测

运用正交试验和单因素试验设计相结合，最终确定石斛SRAP-PCR最优反应体系为Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，2.5 μL 10×buffer，剩余用ddH2O补齐，共25 μL体系。扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，36 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循环;94 ℃变性1 min，根据引物退火温度复性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循环;72 ℃延伸7 min，最后设定4 ℃保存。依据石斛优化后的最优反应体系和扩增程序，对56对引物进行扩增，最终筛选出15对有效引物（表6）。以31种石斛属植物和金石斛的DNA为模板，用筛选出的有效引物在已优化的SRAP反应体系及扩增程序下进行扩增，扩增条带清晰度高（图9），符合试验要求。

3  讨论

SRAP分子标记具有多态性高、引物使用效率高、简单稳定等优点[17]，但也受到反应体系中Mg2+浓度等多种因素的影响[12]，这是因为Mg2+浓度变化可能会减弱Taq DNA聚合酶活性，降低引物和DNA的结合效率，此外，Mg2+浓度变化也会影响DNA和PCR产物的解链温度，从而产生引物二聚体降低产物的特异性[20]。正交试验结果证实Mg2+浓度是影响石斛属植物SRAP-PCR反应体系的重要因子之一。DNA做为扩增反应的基础，其浓度过大或过小时，PCR扩增会产生许多不需要的非特异性产物或不能扩增到任何产物[21]，但本试验中不同的DNA浓度均能扩增出清晰明亮的条带。dNTPs浓度对扩增产物的量有较大的影响，浓度过低会导致反应速度下降，扩增产物不稳定或扩增出来的条带模糊不清，浓度过高会提高碱基错配率和试验成本[22]，試验结果表明dNTPs浓度对石斛属植物SRAP-PCR反应体系的影响最显著。Taq DNA聚合酶浓度对SRAP-PCR扩增产生显著的影响，其浓度过高易出现非特异性条带，并增加试验成本，其浓度过低会影响新链合成效率，甚至无扩增[23]。在SRAP-PCR扩增反应中引物的浓度直接影响扩增产物的质量，浓度过高易出现非特异性条带，并形成引物二聚体，浓度过低则扩增产物量无法满足要求[24]。循环次数、退火温度对石斛SRAP- PCR扩增产生一定的影响，循环次数减少，扩增的条带相对减少且清晰度降低，反之循环次数越多，则会产生非特异性扩增。另外，退火温度太高也会影响引物和模板DNA的结合率降低，从而减少条带数。

本研究最终确定的石斛属植物SRAP-PCR最佳反应体系为：扩增体系为25 μL，其中Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，剩余用灭菌的ddH2O补足。最优扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min;36 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循环;94 ℃变性1 min，根据引物退火温度复性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循环;最终72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。以上述最佳反应体系与最优扩增程序为基础进行引物筛选，在56对引物中筛选出15对重复性较好、多态性较高、扩增条带较为清晰的引物。